t-7i*组成的一组miRNAs,该组合可应用于检测肝癌，特别 是早期肝癌。
[0041] 本发明人通过对近万例慢性皿sAg-阳性病人的每年体检的队列进行研究，并收 集了其中发生肝癌的患者确诊半年至一年半W前的血清，通过筛选出与未发生肝癌者相比 差异表达的miRNAs谱，得到了能够预测病毒性肝炎患者高风险人群发生肝癌的可能性的 特异性miRNAs分子标记。
[0042]基于本发明人的上述新发现，提供了特异性检测所述的hsa-miR-193a-3p、 hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429 和let-7i* 的检测试剂的用途，用于制备检测 肝癌，特别是早期肝癌的试剂盒。
[0043] 可采用各种本领域已知的技术来检测所述的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、 hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*的存在或表达情况，运些技术均包含在本发明中。例 如可用已有的技术如聚合酶链式反应技术（PCR)，Southern印迹法，原位杂交法，DNA序列 分析等，运些方法也可结合使用。
[0044] 本发明还提供了用于在分析物中检测所述的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、 hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*的存在表达情况的试剂。作为一种优选方式，可W 采用其特异性扩增引物或特异性探针，通过RCR法来确定所述miRNA的量。针对miRNA的 特异性引物和探针的设计是本领域人员熟知的技术。
[004引作为本发明的优选方式，检测血浆或血清中的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429 和let-7i*。
[0046] 本发明还提供了用于检测肝癌，特别是早期肝癌的试剂盒，包含：特异性检测人 hsa-miR-193a-3p的检测试剂；特异性检测人hsa-miR-369-5p的检测试剂；特异性检测人 hsa-miR-672的检测试剂；特异性检测人hsa-miR-429的检测试剂和特异性检测人let-7i* 的检测试剂。作为一种优选方式，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增引物和DNA 探针。
[0047] 可选的，所述的试剂盒中还包含：用于检测甲胎蛋白（AFP)的检测试剂。上述的 miRNA组合再联合AFP检测，从而获得更为准确的诊断结果。
[004引所述的试剂盒中还可包含RNA提取试剂、逆转录试剂、核酸扩增试剂、无RNA酶的 纯水、阴性质控品、阳性质控品等。
[0049] 可选的，所述用于提取RNA的试剂为Trizol试剂、磁珠法抽提RNA所用的试剂、柱 法抽提RNA所用的试剂。
[0050] 本发明所述的试剂盒中逆转录试剂包括：检测所述miRNA组合中的各miRNA的逆 转录引物、逆转录酶、逆转录反应体系。
[0051] 所述逆转录酶可W为M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
[0052]所述逆转录反应体系可W包括：逆转录缓冲液、DTT、dNTPs、无RNA酶的纯水，RNA 酶抑制剂，及对照或提取出的RNA。
[0053] 本发明所述的核酸扩增试剂可W包括：正向引物、反向引物、寡核巧酸探针、核酸 扩增酶、定量核酸扩增反应体系。
[0054] 所述核酸扩增酶可W为DNA扩增酶；
[0055] 所述定量核酸扩增反应体系可W包括定量缓冲液、dNTPs、纯水，及逆转录得到的 cDNA。
[0056] 本发明所述的阴性质控品可W为正常人血清、无肝癌的慢性乙肝患者血清、牛 血清白蛋白溶液或生理盐水溶液；阳性质控品可W为经过测定为阳性的早期肝癌患者血 清，或为特定拷贝数的hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429、 let-7i*寡核巧酸。
[0057] 为了避免扩增产生的误差，还可设置内参。在本发明的实施例中，WU6SnRNA作 为内参。应理解，选择其它类似的基因作为内参也是可行的。
[0058] 本发明还进一步提供了肝脏肿瘤极早期诊断相关血清小分子核酸的检测方法，包 括W下步骤：
[0059] (1)血清标本中RNA的提取：
[0060] 取待测病人血清、阴性对照血清、阳性对照血清，按照所选用的RNA抽提试剂盒的 标准操作方法，或使用的核酸抽提试剂盒的说明书，抽提血清标本中的RNA;
[0061] (2)用上述试剂盒进行检测：
[0062] 对内参和所述miRNA组合同时进行定量测定。将提取的RNA加入至预混合的含有 逆转录引物、逆转录酶、逆转录反应体系的反应管中，进行逆转录；然后使用CDNA加入至含 有正向引物、反向引物、寡核巧酸探针、核酸扩增酶、定量核算扩增反应体系的定量核酸扩 增反应管中，进行扩增，使用巧光定量PCR检测仪进行检测。
[0063] (3)通过logistic regression模型联合分析循环系统中多个特定的小分子核 酸，用W判断肝癌发生的可行性：
[0064] 较优但不仅限于利用logistic regression方程：
[006引Log (P/(I-P) ) = (0. 1550 1) + (0. 0 1 785) let-7i*+(-0. 02857) miR-193a-3p+(-0. 01955)miR-369-5p+(0. 03704)miR-429+0). 04277)miR-672及临界值判 断肝癌发生的可行性；其中，let-7i*、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-429、 hsa-miR-672的表达水平是W UeSnRNA为内参检测得到，模型中的Log(P/(l-P))值在至少 一种极早期肝癌患者血浆中的表达与在至少一种阴性对照血浆中的表达相比被上调。
[0066] 本发明首次提出通过检测患者体液中（特别是循环系统中）特异性miRNAs分子 标记的拷贝数，并利用诊断模型对病毒性肝炎患者发生肝癌的风险进行判定，在诊断肝细 胞癌，尤其是在无症状高风险个体的群体中鉴定早期肝癌具有80%W上的准确性。
[0067] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第=版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0068] 实施例1、队列筛选能够预测病毒性肝炎患者高风险人群发生肝癌可能性的特异 性miRNAs分子标记
[0069] 对近万例慢性皿sAg-阳性病人的每年体检的队列进行研究，并收集了其中发生 肝癌的患者的确诊患病的半年至一年半W前的血清，筛选出与未发生肝癌者相比差异表 达的miRNAs谱，筛选能够预测病毒性肝炎患者高风险人群发生肝癌的可能性的特异性 miRNAs分子标记。
[0070] 研究用的主要血浆样本来自于东方肝胆外科医院，收集来自2007年4月至 2014年3月的每年进行体检的队列，其中包含9287个慢性乙肝表面抗原化BsAg)阳 性（皿sAg-阳性）的患者。运些参与者体检时进行皿sAg、谷丙转氨酶（ALT,alanine aminotransferase)、B超和甲胎蛋白（AFP)检查。每次体检的血浆均被有效的保存起来。
[0071] 取研究期间，被临床诊断为肝癌的195个皿SAg-阳性的患者做后续研究，主要依 据如下：（1)发生肿瘤时W及发生之前的两次血浆都有收集储存；（2)循环miRNA数据与 ALT、B超和AFP等各项指标能够相互比较的样本。（3)肝癌筛查间隔在半年-一年之间。 此195个患者临床诊断约一年W前的血浆编入G2:极早期肝癌患者组；另外，从没有肝癌临 床诊断的皿sAg-阳性的患者中随机选择了 435例，运435例病人约一年W前的血浆仍然诊 断为皿SAg-阳性，将之编入Gl:慢性乙肝患者组。通过比较G2和Gl组的循环miRNA表达 差异，在影象学W及AFP诊断肝癌之前，通过循环miRNA特征预测肝癌发生的可能。
[0072] 首先，从G2和Gl组中分别选出各项基本特征基本一致的各26例样本作为发现集 (图1，发现集），利用可W检测669种人源miRNAs的化qmanmiRNAs忍片筛选二者之间的 差异表达miRNAs谱，得到8个差异表达的miRNAs(见表1)，运些miRNAs可W有效地区分 G2和Gl组。
[0073] 表1、G2和Gl组中8个差异表达的miRNAs
[0074]发现集
[00巧]
[0076] 其中，▼表示表达显著性下降，▲表示显著性上升
[0077] 通过进一步扩大样本量，获取105个慢性乙肝病毒感染患者（Gl组）及65个极早 期肝癌患者（G2组）作为训练集，用定量RT-PCR方法对8个候选miRNAs进行进一步的验 证。W并行检测AFP的结果作为对比。同时检测上述miRNA组合与AFP联合诊断的结果。