Eb病毒编码的eber-1的应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体设及一种用于检测鼻咽癌石蜡包埋样品中 邸病毒编码的小RNA-UEBER-1)表达水平与鼻咽癌复发和转移关系的原位杂交探针、检测 试剂盒及其应用方法。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌（化SO地aryngealCarcinoma,NPC)是我国南方地区常见的头颈部恶性肿 瘤，由于发病部位隐蔽，难于早期发现，且极易发生转移，初诊患者颈部淋己结转移率高达 80 %。放射治疗是目前鼻咽癌临床上最常用的治疗手段，60~70 %的患者能取得较好的疗 效，但仍有20~30%的患者会出现复发和转移。复发和转移是临床上导致鼻咽癌患者死亡 的主要因素之一，且放化疗对治疗鼻咽癌的复发、转移效果不理想，因此，筛选新的鼻咽癌 早期诊断及预后判断的分子标记物，对于鼻咽癌的临床治疗有着重要的指导意义，同时相 比较传统的放化疗手段，生物治疗的方法更适合复发和转移鼻咽癌的治疗，其中基因疗法 对防治鼻咽癌的复发、转移具有更重要而广阔的临床应用前景，筛选鼻咽癌基因治疗的祀 点也同样意义重大。
[0003] 鼻咽癌的发病与邸病毒巧PSteinBarrvirus,邸V)感染密切相关。邸病毒是一 种普遍存在的人类瘤疹病毒，可W感染全球95%左右的成人人口，除偶尔有一小部分人也 会引起传染性的单核细胞增多症外，大部分被感染者不会出现任何的临床症状，绝大多数 情况下邸病毒可W在宿主体内长期潜伏感染。然而，在某些情况下潜伏感染的邸病毒会 导致恶性肿瘤的发生，包括B细胞来源的伯基特和何杰金氏淋己瘤，W及上皮细胞来源鼻 咽癌和胃癌等。邸病毒导致恶性肿瘤发生的机制目前尚未完全明了，可能与邸病毒本身 编码一系列基因的表达有关，如邸病毒编码的潜伏膜蛋白ULatentMembraneProteinl, LMPl)作为一种致瘤蛋白，能激活许多宿主细胞内癌基因的表达，抑制抑瘤基因的结构和功 能。
[0004] EBV作为双链DNA病毒其基因组大小约为170化，除了可转录一系列蛋白编码基 因，最近发现邸病毒还可编码一些小RNA分子（长度<200nt)，包括微小RNAOnicroRNA，长 度为19-2化t)。目前已发现EBV可编码25个miRNAs前体，加工成44个成熟的miRNAs， 且EBV编码的miRNAs在EBV基因组上成簇分布，可W分为BART和BHRFl两组。而邸病 毒编码的小RNA则主要有邸病毒编码的小RNA-I巧pstein-Barrvirusencodedsmall RNA1,E邸R-1)和邸病毒编码的小RNA-2 巧pstein-BarrvirusencodedsmallRNA 2,EBER-2)。迄今为止有关邸ER-I与鼻咽癌病人的辅助诊断或者疗效预测等方面均没有文 献报道。我们通过研究表明，EBER-I在鼻咽癌组织中的表达显著升高，但高表达邸ER-I的 鼻咽癌患者比低表达邸ER-I的鼻咽癌患者不容易发生复发和转移，预后要好，因此，针对 E邸R-I设计专用原位杂交探针及检测试剂盒，用于检测鼻咽癌组织中邸ER-I的表达水平 有望为临床上对鼻咽癌进行辅助诊断复发和转移的预测提供参考。
【发明内容】
[00化]本发明的目的在于提供一种邸病毒编码的小RNA-UEBER-1)的原位杂交探针、试 剂及其应用方法，利用邸ER-I的序列可W制备用于鼻咽癌辅助诊断复发和转移的预测制 剂，并提供一种性价比高、易于推广应用的邸ER-I的检测试剂盒。
[0006] 邸病毒编码的邸ER-I的应用方法，所述的邸ER-I用于制备鼻咽癌辅助诊断复发 和转移的预测制剂；在鼻咽癌组织中检测到邸ER-I的表达水平与鼻咽癌患者的临床分期， 肿瘤大小和淋己结转移均呈负相关关系；E邸R-I的序列：aggaccuacg州gcccuagagguuuugc U曰邑邑邑曰邑邑曰邑曰C邑U邑U邑U邑邑CU邑U曰邑CC曰CCC邑UCCC邑邑邑U曰C曰曰邑UCCC邑邑邑U邑邑U邑曰邑邑曰C邑邑U邑UCU邑U邑邑UU邑UCUUCCC3g3CUCUgCUUUCUgCCgUCUUCggUC33gimCC3gCUggUggUCCgC3UgUUUU〇(SEQNO. 1)
[0007] 所述的鼻咽癌辅助诊断复发和转移的预测制剂为原位杂交检测制剂。
[0008] 所述的鼻咽癌辅助诊断复发和转移的预测制剂中包括检测邸ER-I的原位杂交探 针，序列为：AGACACCGTCCTCACCACCCGGGACTTGTA(SEQNO. 2)。
[0009] 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。
[0010] 试剂盒中包括：检测邸ER-I的原位杂交探针，序列为： W11]AGACACCGTCCTCACCACCCGGGACTTGTA;检测内参基因GAPDH的原位杂交探针，序列 为：CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCU(SEQNO. 3)。
[0012] 试剂盒中还含有：地高辛寡核巧酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物 检测试剂、DAB染色试剂； 阳01引其它常规生物化学试剂，包括20x巧樣酸钢缓冲溶液（salinesodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖值extransulphate),去离子甲酯胺值eionizedF'ormamide)， 多聚腺巧酸（polyadenylicacid，PolyA),多聚脱氧腺巧酸（polydeo巧aden}dicacid, 化IydA)，变性剪切的蛙精DNA(denaturedandshearedsalmonspermDM,ssDNA)， 酵母转运RNA(yeastt-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇值TT)，50x邓罕氏缓冲液值enhar化s's solution)，憐酸缓冲液（PBSbuffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白度SA)，S乙醇胺 (TEA)，醋酸酢，阻断试剂度lockingreagentagent)，TNB缓冲液（即：pH7. 5 的 0.IM Tris-Cl+0. 15M化C1+0. 5 % 阻断试剂），TNT缓冲液（即：pH7. 5 的 0.IMTris-Cl+0. 15M 化C1+0. 05%Tween20)。
[0014] 我们通过原位杂交在存档的鼻咽癌石蜡组织标本中发现邸ER-I的表达与鼻咽癌 患者的预后密切相关，在鼻咽癌组织中检测到邸ER-I的表达水平与鼻咽癌患者的临床分 期，肿瘤大小和淋己结转移均呈负相关关系。即越是晚期鼻咽癌患者，鼻咽癌瘤体越大，淋 己结转移越严重，EBER-I的表达水平反而下降。提示邸ER-I可作为鼻咽癌复发和转移预 测的分子标志。本发明为肺癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具 有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【附图说明】
[0015] 图1为原位杂交检测邸ER-I在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；
[0016] 在130例正常鼻咽上皮（NP巧样品中，115例（88. 5% )基本检测不到邸ER-I的表 达（negative,图1A)，仅在15例（11.5% )中有邸ER-I低表达；而在301例鼻咽癌（NPC) 中仅87例（28. 9% )检测不到邸ER-I的表达（图1B)，而在214例中检测到有邸ER-I的 表达（71. 1% )，其中165例为低表达（图1C)，而在49例（16. 3% )中为高表达（图ID); 图IE为统计结果，P<0. 001。
[0017] 图2为邸ER-I的表达水平可用于鼻咽癌的辅助诊断；
[0018]利用受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve,R0C)分 析发现邸ER-I的表达水平可W较好地用于区分鼻咽癌和非鼻咽癌患者。曲线下面积（area underthecurve,AUC)为 0.815 (95%置信区间：0.776-0. 854,P<0. 001)，灵敏度和特异性 分别为72. 5%和83. 5%。
[0019] 图3为邸ER-I的表达水平与鼻咽癌患者临床参数相关性；
[0020] 在鼻咽癌组织中检测到邸ER-I的表达水平与鼻咽癌患者的临床分期（图3A，I~ IV分别为临床I、II、III、IV期），肿瘤大小（图3B，Tl~T4)和淋己结转移（图3C，NO为 无淋己转移，Nl~N3淋己结转移程度逐渐增加）均呈负相关关系。即越是晚期鼻咽癌患 者，鼻咽癌瘤体越大，淋己结转移越严重，EBER-I的表达水平反而下降。
[0021] 图4为鼻咽癌中邸ER-I的表达与鼻咽癌患者预后的关系
[0022] 鼻咽癌中邸ER-I的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，E邸R-I高表达（化曲）的 患者生存时间要明显长于邸ER-I低表达化OW)或者不表达（negative)的患者。
【具体实施方式】
[0023]W下结合【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0024] 实施例1，原位杂交检测邸ER-I在正常鼻咽上皮和鼻咽癌中的表达情况 W25] 1.材料方法
[00%] 1. 1设计并合成杂交探针
[0027] 为了采用原位杂交方法检测邸邸-1的表达情况，