基于pcr用于平行检测生物材料的测定的制作方法
【专利说明】基于PCR用于平行检测生物材料的测定
[0001] 本发明涉及用于检测样品中至少一种靶分子特别是用于检测样品中的肽、蛋白 质、脂质或碳水化合物的新方法；用于所述方法的至少一种探针；用于所述方法的多种所 述探针或所述探针的文库，以及用于实施所述方法的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 涉及例如肽或蛋白质的分子相互作用（例如，抗体-抗原相互作用、激素-受体相 互作用、病毒-受体相互作用、酶-底物相互作用等）代表了任何生物系统中最复杂和重要 的过程。其检测可提供关于系统状态的有价值信息，并因此可提供具有诊断、治疗或商业价 值的重要信息。例如，以下是可通过监测肽或蛋白质相互作用得到的信息类别的非穷举列 表。
[0003] a)诊断未知原因的呼吸道感染性疾病
[0004] b)研宄未知病因的CNS感染
[0005] c)研宄自身免疫病
[0006] d)研宄与感染原（infectious agent)具有潜在联系的癌症
[0007] e)研宄主要的慢性疾病，例如多发性硬化症、糖尿病、肥胖和其他代谢综合征、克 隆病（Crohn' s disease)和溃疡性结肠炎等
[0008] f)用于任何人类医疗状况（medical condition)的生物标志物的发现。
[0009] 然而，与基于核酸的检测不同，目前没有用于放大生物系统中的基于肽、蛋白质、 脂质或碳水化合物之相互作用的有效方法。这意味着，特别是在量低的情况下，许多相互 作用未识别或未检测。需要对这种相互作用或信号进行特异性放大以提供适当的灵敏方 法。这种方法将对生物和医学研宄的所有领域具有重大影响。后者包括但不限于：表征抗 体介导的免疫应答，以用于诊断和疫苗相关用途；筛选生物过程或细胞信号转导中的蛋白 质-蛋白质相互作用；筛选药物-蛋白质结合或相互作用，例如可能导致副作用的脱靶或非 特异性结合；筛选蛋白质-糖蛋白结合，例如鉴定用于进入细胞的病毒-受体结合；表征蛋 白质上的翻译后聚糖和寡糖修饰，以用于表征和开发生物药物；以及筛选生物过程中的蛋 白质-磷脂相互作用，例如确定凝血蛋白如何与细胞膜结合。
[0010] 在监测抗体介导的免疫应答的领域，能够监测生物系统中的基于肽或蛋白质的信 号将具有很大价值。例如，涉及感染原的任何疾病将很可能产生针对该病原的特异性宿主 应答。这包括这样的病症，例如由目前难以诊断的感染原引起的脑炎。此外，来自非感染性 疾病（例如癌症、自身免疫病和慢性疲劳综合症）的抗体介导的免疫应答也代表了可能从 监测生物系统中之基于肽或蛋白质的信号而受益的领域。
[0011] 尽管目前可以监测响应于抗体介导之免疫应答的肽或蛋白质，但是大部分用于基 于肽或蛋白质检测的当前技术仅允许检查针对单个或少量目标病原的免疫应答。这使得 系统因重复、费力、耗时和昂贵受到质疑。如果可以提供用于抗体监测的高通量基于肽或 蛋白质的筛选方法或微阵列，则这些缺点可以被克服。尽管已经报道了用于抗体监测的高 通量基于肽的微阵列，但是由于低灵敏度和缺少再现性，其并未被广泛使用OLAndresen 和 C. (?HitzillgCI* (2009) Deciphering the antibodyome-peptide arrays for serum antibody biomarker diagnostics. Current Proteomics，2009,6,1-12)〇
[0012] 因此，本文描述的本发明旨在克服与现有技术相关的缺点。
【发明内容】
[0013] 根据本发明的第一个方面，提供了用于检测和/或量化样品中至少一种靶分子的 探针，其包含：
[0014] a)对所述革El分子具有特异性的至少一种结合伴侣（binding partner);以及与其 连接的
[0015] b)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含：
[0016] i)第一序列，其与用于扩增所述寡核苷酸的正向引物序列互补；
[0017] ii)第二序列，其与用于扩增所述寡核苷酸的反向引物序列互补；
[0018] iii)位于所述第一序列和所述第二序列之间的核苷酸鉴定序列或条形码，其中所 述条形码充当所述靶分子的指示物并且由一定数目的以独特顺序排列的核苷酸组成，并且 进一步，其中由所述核苷酸的数目和性质提供的所述核苷酸的独特排列的数目大于所述样 品中靶分子的数目。
[0019] 本文提到的对所述靶分子具有特异性的结合伴侣意指这样的结合伴侣，其能够与 所述靶分子结合以排斥与不同或类似性质的其他靶分子的结合，并且在一些情况下，确实 不能与任何其他靶分子结合。
[0020] 在本发明的一个优选实施方案中，可提供多种探针作为探针文库，一旦开发了新 探针，则可以扩展该文库，并且额外地或可选地，所述文库还可进行定制以用于特定目的， 例如但不限于，基于医院的诊断（例如，诊断急性呼吸道感染，其中可能需要约100种探 针）。然而，扩展的文库可包含IO 5或106种探针，并且当具有这个大小时，期望得到模拟表 位（mimitope)(模拟原始天然表位的表位），这将使文库极为强大并可用于某些应用，例如 研宄自身免疫病的交叉反应抗原和生物标志物的发现。
[0021] 在本发明的一个优选实施方案中，所述结合伴侣具有至少一种对所述靶分子具有 特异性的表位，但是理想地，其具有多种对所述靶分子具有特异性的表位。
[0022] 最优选地，所述结合伴侣包含至少一种并且理想地包含多种肽和/或蛋白质，其 单独地或共同地包含至少一种并且优选地包含多种对待检测之所述肽或蛋白质具有特异 性的表位。
[0023] 在本发明的另一个优选实施方案中，所述探针还具有有助于在多重测定 (multiplex assay)中鉴定祀分子的标签或标记。这种标签或标记的特征在于可通过PCR 扩增，因此理想地包含不同性质（优选容易阅读）的另外的短DNA序列。
[0024] 在实施本发明的时候，用于检测特定类型或种类的靶分子的一组探针可具有共有 标签，从而在使用独特条形码检测所述种类中的个体成员之前或者也许之后使用所述标签 可确定这类或这种靶分子的存在或量。或者，可向特定类型的样品提供共有标签，从而可将 在测定中检测的特定靶分子与特定样品联系起来，例如并且不限于，可使用特定标签来指 定特定患者样品，并且可使用与不同探针相关的条形码检测在该患者样品中发现或与该患 者样品相关的不同靶分子。
[0025] 在一些方面，可以将此标签或标记看作第二条形码系统。使用第一核苷酸鉴定序 列或条形码区（通常为18至5个核苷酸）鉴定特异性靶分子，而使用第二条形码系统鉴定 特异性样品或靶分子的组/类型。例如，当监测特定样品时，如果在一项研宄中研宄10份 不同血清样品，则可将所有PCR产物组合到单个下一代测序运行中（通常降低成本），并且 第二条形码将允许在序列分析期间鉴定每一种特定靶分子所来自的特定样品。
[0026] 在本发明的另一个优选实施方案中，所述标签或标记在远离所述结合伴侣的位点 处与所述探针连接，以免干扰结合伴侣的结合功能。理想地，将所述标签或标记并入本发明 探针的寡核苷酸b)的引物序列i)或ii)的至少之一中。更优选地，将所述标签或标记并 入本发明探针的寡核苷酸b)的引物序列i)或ii)二者中。
[0027] 在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一序列位于距离所述结合伴侣最近的 位置，而所述第二序列位于距离所述结合伴侣最远的位置。或者，所述第二序列位于距离所 述结合伴侣最近的位置，而所述第一序列位于距离所述结合伴侣最远的位置。
[0028] 在本发明的另一个优选实施方案中，所述核苷酸鉴定序列或条形码包含以下组核 苷酸或由其组成：18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个核苷酸，并且在任何情况 下，足以提供实施测定所需的序列组合数的核苷酸数目。例如，10个核苷酸提供1，048, 576 种组合，而15个核苷酸提供1，073, 741，824种组合。我们目前优选的设计包含16个核苷 酸，4, 294, 967, 296 种组合。
[0029] 在本发明的另一个优选实施方案中，对于低通量应用，所述条形码区可包括或包 含至少一个用于酶促切割所述条形码区的限制性酶切位点（例如BamHl或HindIII位点）， 但是可使用本领域技术