质以及结合伴侣-P的结合，但是优选在液相中进行该捕获以提高特异性（即， 降低背景结合）。首先将包被有例如特异性抗体（例如，抗人IgG或抗人IgM)的磁珠与人 血清孵育，随后充分洗涤。然后在合适的缓冲系统中向抗体-珠混合物添加 P-O探针文库。 孵育后，将所述珠充分洗涤以除去任何未结合的P-O探针。
[0102] 5) PCR扩增：将PCR反应混合物（包含引物、dNTP和酶）不进行任何进一步处理直 接添加至经洗涤的珠。PCR扩增的循环数可变化，但是通常应保持最少以保持肽量化的精确 度。
[0103] 6)读出条形码：可使用多种本领域技术人员已知的现有技术实现条形码的鉴定 和量化。当同时研宄超过100种靶标时，在"发现"型应用中可使用高通量大规模平行测序 (例如，Ion Torrent平台）。对于10-100种祀标，可使用Droplet Digital PCR(例如， BioRad系统），而对于少于10种祀标的样品，可应用Luminex或qPCR进行鉴定。 具体实施例
[0104] 本文使用两种示例的探针/P-O和对于各自具有特异性的阳性抗体证明了本发明 的可行。在此例子中的革G蛋白是流感病毒和登革病毒（denuge virus)特异性的表位。
[0105] P-O缀合物和引物设计（参见图5):
[0106] 1)选择两种特异性肽表位（YPYDVPDYA和YKQPLWPNQISW，在图5部分A的左手边 示出）：一种来自流感病毒，而另一种来自登革病毒。
[0107] 2)在此具体实施例中，对于寡核苷酸设计，向每个不同条形码区中并入特定限制 性酶切位点，即，每个条形码区中并入不同限制性位点，以便可以使用酶消化来确认测序结 果。将BamHl并入到流感特异性探针的条形码区中，而将HindIII并入到登革特异性探针 的条形码区中。
[0108] 3)在此具体实施例中，在此试验中使用8nt的条形码区。用于寡核苷酸扩增的PCR 扩增引物（B)和用于独特条形码区测序的测序引物（C)在图5中示出。值得注意地，这些 引物被设计用于此具体试验，而且本发明不限于此，这些引物是对本发明的示例。本领域技 术人员可设计用于不同应用的其他引物。
[0109] 实验程序
[oho] 本研宄中使用的抗体
[0111] 1) ·抗流感⑴单克隆抗体：HA-标签（c29F4)兔 mAb (Cell Signaling Technology 货号 #3724S) 〇
[0112] 2)抗登革（d)人血清：来自已知被登革病毒感染两次的个体。
[0113] 免疫捕获
[0114] 1)制备图5A的稀释的流感和登革（I :D) P-O探针（各约30, 000分子/μ 1)的混 合物。
[0115] 2)将10 μ I I :D P-O探针混合物添加至5 μ 1血清样品和85 μ I IP缓冲液（25mM Tris、150mM NaCl、pH 7. 2)，并且将混合物在室温搅拌孵育30分钟。
[0116] 3)在孵育期间，如下制备蛋白质G珠（Pierce)，即用于免疫球蛋白的分离和纯化 的亲和基质：将Iml IP缓冲液添加至珠。然后将珠在2500 Xg下离心2分钟，除去上清液。 将这个步骤重复两次，然后使珠重悬在500 μ I IP缓冲液中。
[0117] 4)在孵育之后，将50 μ 1珠添加至血清/P-O混合物。将血清/P-O/珠溶液再在室 温下搅拌孵育30分钟。
[0118] 5)孵育后，添加500 μ I IP缓冲液并将珠在2500 Xg下离心2分钟。除去上清液 并且向珠添加 Iml IP缓冲液。将这个步骤重复3次。
[0119] 6)使珠重悬在39 μ 1水中并转移到PCR管以在PCR中直接使用。
[0120] PCR 反应
[0121] 1)在含有来自免疫捕获的珠的管中直接建立50 μ I PCR反应。所述50 μ I PCR反 应包含54 110\缓冲液、4以12.51111(1阶1\14 1各引物（85-]\113卩和85-]\1131〇和0.24 1 Atlas Taq聚合酶。
[0122] 2)40个循环的PCR循环条件如下：94°C变性10秒，54°C退火10秒并且72°C延伸 15秒。
[0123] 3)在2 %琼脂糖凝胶上分离PCR产物。
[0124] 限制性酶消化
[0125] 1)使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen)根据制造商的说明书来纯化PCR产 物。用30 μ I TE缓冲液洗脱纯化的PCR产物。
[0126] 2)用BamHI或HindIII建立30 μ 1消化混合物。消化反应包含3 μ 1纯化的PCR 产物、34 110\缓冲液，34 110\85六，0.54 1限制性酶和20.5以1!120。
[0127] 3)将消化反应在37°C孵育2小时，然后在2%琼脂糖凝胶上分离。
[0128] 测序：
[0129] 1)对于Sanger测序，将纯化的PCR产物发送至外部服务提供者以使用图5中列出 的引物BSlF和BS2R进行Sanger测序。
[0130] 深度测序：
[0131] 我们还设计了 P-O缀合物的寡核苷酸部分以使得PCR富集步骤的产物可立即准备 用于通过深度测序量化。另外，我们还已经开发了能够区分并检测本发明探针之条形码区 的qPCR测定。深度测序分析通常主要用于高通量筛选样品，而qPCR更可能成为本发明技 术的低通量应用所选择的平台。这些新方法在图8中概括，并且在此详细描述：
[0132] 步骤1-捕获：将磁性蛋白质A/G珠放入印pendorf管，所述管含有200 μ 1封闭/ 结合缓冲液（1><了85-1'[0.05%了￥6611]中的1%封闭试剂[1?0(*6#11 096 176 001]、0.111^/ ml BSAUOO μ g/ml终浓度的tRNA)。虽然在这个捕获程序的实例中使用来自Roche的封闭 缓冲液，但是本申请整体上不以任何方式依赖于Roche封闭缓冲液的使用，尤其是对于构 建体与其特异性靶标的结合来说；其他封闭缓冲液可能同样有效，可根据各试剂说明书自 由使用。添加血清样品（或者在先导性实验的单克隆抗体）并且孵育以使存在的抗体与磁 珠结合。孵育后，将磁珠用500 μ I 1XTBS-T(0. 05% Tween)洗涤以除去未结合的抗体。然 后将同样在200 μ1结合缓冲液中的P-O缀合物（P-Ο缀合物探针的混合物，即探针1-6)添 加至含有磁珠：抗体复合物的印pendorf管。P-O缀合物的肽区域在该孵育过程中与其特 异性抗体结合。孵育后，将磁珠在500 μ I 1XTBS-T(0. 05% Tween)中洗涤以除去未结合的 P-O探针。
[0133] 步骤2-检测：将所述磁珠直接收集到含有Ion Torrent特异性引物的50 μ I PCR mastermix中。用Pfu校正聚合酶进行PCR。Ion Torrent引物的P-O特异性区与位于P-O 条形码外部的探针的18nt引物互补序列结合。在P-O条形码任意侧的该ISnt序列在所有 P-O缀合物中通常是相同的，允许多重Ion Torrent PCR。最优选地，除了接头序列外，每个 Ion Torrent引物组还含有独特的标签或标记序列。通过PCR扩增捕获的寡核苷酸，然后 通过柱纯化以除去PCR试剂和磁珠。将纯化的PCR产物在10 μ 1中洗脱并且在生物分析仪 DNA 1000 Chip上探询DNA的质量和数量。然后通过Ion Torrent NGS分析该样品。还可 通过Taqman定量PCR监测所述样品，其中Taqman探针是P-O条形码特异性的。
[0134] 示例性探针
[0135] 除了图5中示出的探针外，还产生了另外6种构建体用于实施所述技术。这些构 建体的肽和寡核苷酸序列在下表中示出。
[0136]
【主权项】
1. 用于检测和/或量化样品中至少一种靶分子的探针，其包含： a) 对所述靶分子之一具有特异性的至少一种结合伴侣；以及与其连接的 b) 寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含： i) 第一序列，其与用于扩增所述寡核苷酸的正向引物序列互补； ii) 第二序列，其与用于扩增所述寡核苷酸的反向引物序列互补； 和 iii) 位于所述第一序列和所述第二序列之间的是核苷酸鉴