人员已知的任何其他合适的限制性酶切位点。
[0030] 在本发明的另一个优选实施方案中，所述探针包含单链DNA，但是可使用双链DNA 以提供稳定性、减少非特异性相互作用并减少潜在的空间位阻。
[0031] 根据本发明的第二个方面，提供了用于在多重测定中检测至少一个样品中的至少 一种靶分子的多种探针，其中每种探针包含：
[0032] a)对至少一种所述靶分子具有特异性的至少一种结合伴侣；以及与其连接的
[0033] b)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含：
[0034] i)第一序列，其与用于扩增所述寡核苷酸的正向引物序列互补；
[0035] ii)第二序列，其与用于扩增所述寡核苷酸的反向引物序列互补；
[0036] iii)位于所述第一序列和所述第二序列之间的核苷酸鉴定序列或条形码，其中所 述条形码充当所述靶分子的指示物并且由一定数目的以独特顺序排列的核苷酸组成，并且 进一步，其中由所述核苷酸的数目和性质提供的所述核苷酸的独特排列的数目大于所述样 品中靶分子的数目；以及
[0037] c)有助于在多重测定中鉴定所述靶分子的标签或标记。
[0038] 在本发明的一个优选实施方案中，所述第一序列和所述第二序列是一些并且理想 地全部探针共有的，以有助于在本文描述的本发明方法中扩增所述寡核苷酸。
[0039] 在本发明的另一个优选实施方案中，至少两种并且理想地更多种所述探针具有不 同结合伴侣，从而可鉴定至少一个样品中的多种不同靶分子。
[0040] 更优选地，用于检测特定类型或组的靶分子的探针具有第一共有标签或标记，而 用于检测另一特定类型或组的靶分子的探针具有第二共有标签或标记。额外地或可选地， 用于鉴定特定样品的探针具有另一共有标签或标记。理想地，这些标签或标记是在本发明 探针的寡核苷酸b)的引物区i)或ii)中的至少之一或两者中提供的短核苷酸序列。在这 样的情形下，短意指3-15个核苷酸长，理想地9-11个核苷酸长，包括9、10或11个核苷酸 中的任意之一。在我们的设计中目前优选的标签/标记为10个核苷酸长。
[0041] 根据本发明的第三个方面，提供了用于检测样品中至少一种靶分子的方法，其包 括：
[0042] 1)使受试样品暴露于至少一种探针，所述探针包含：
[0043] a)对所述靶分子具有特异性的至少一种结合伴侣；以及与其连接的
[0044] b)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含：
[0045] i)第一序列，其与用于扩增所述寡核苷酸的正向引物序列互补；
[0046] ii)第二序列，其与用于扩增所述寡核苷酸的反向引物序列互补；
[0047] iii)位于所述第一序列和所述第二序列之间的核苷酸鉴定序列或条形码，其中所 述条形码充当所述靶分子的指示物并且由一定数目的以独特顺序排列的核苷酸组成，并且 进一步，其中由所述核苷酸的数目和性质提供的所述核苷酸的独特排列的数目大于所述样 品中靶分子的数目；
[0048] 在使得所述探针能够与待检测的所述靶分子结合以形成至少一种探针-靶分子 缀合物的条件下进行所述暴露；
[0049] 2)从所述样品分离所述缀合物；
[0050] 3)使所述分离的缀合物暴露于至少一种正向引物和反向引物对以及适合于进行 聚合酶链式反应（PCR)的试剂，其中每对的一个成员与一个所述探针的所述第一序列互 补，而每对的另一个成员与所述同一探针的所述第二序列互补；
[0051 ] 4)使用聚合酶链式反应（PCR)扩增所述寡核苷酸；以及
[0052] 5)通过确定所述扩增的寡核苷酸的存在来检测所述样品中的所述靶分子。
[0053] 根据本发明的第四个方面，提供了用于检测至少一个样品中的至少一种靶分子的 多重性方法，其包括：
[0054] 1)使至少一种受试样品暴露于多种探针，其中每种探针包含：
[0055] a)对至少一种所述靶分子具有特异性的至少一种结合伴侣；以及与其连接的
[0056] b)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含：
[0057] i)第一序列，其与用于扩增所述寡核苷酸的正向引物序列互补；
[0058] ii)第二序列，其与用于扩增所述寡核苷酸的反向引物序列互补；
[0059] iii)位于所述第一序列和所述第二序列之间的核苷酸鉴定序列或条形码，其中所 述条形码充当所述靶分子的指示物并且由一定数目的以独特顺序排列的核苷酸组成，并且 进一步，其中由所述核苷酸的数目和性质提供的所述核苷酸的独特排列的数目大于所述样 品中靶分子的数目；
[0060] c)有助于在多重测定中鉴定所述靶分子的标签或标记；
[0061] 在使得所述探针能够与待检测的所述靶分子结合以形成探针-肽缀合物的条件 下进行所述暴露；
[0062] 2)从所述样品分离所述缀合物；
[0063] 3)使所述分离的缀合物暴露于至少一种或多种正向引物和反向引物对以及适合 于进行聚合酶链式反应（PCR)的试剂，其中每对的一个成员与一种所述探针中的所述第一 序列互补，而每对中的另一个成员与所述同一探针中的所述第二序列互补；
[0064] 4)使用聚合酶链式反应（PCR)扩增所述寡核苷酸；以及
[0065] 5)通过确定所述扩增的寡核苷酸和/或所述标签的存在来检测所述样品中的所 述革El分子。
[0066] 在本发明的一个优选方法中，可使用任何优选的实验室技术分离所述缀合物，例 如洗涤、过滤、迀移、沉淀、免疫沉淀或离心。
[0067] 理想地，实施免疫沉淀，其中使用探针的结合伴侣或者待检测肽或蛋白质的抗体 选择性地从样品除去缀合物，理想地，抗体是单克隆抗体，但是也可使用多克隆抗体。
[0068] 在本发明的另一个优选方法中，可通过对所述核苷酸鉴定序列或条形码测序来进 行对所述样品中所述靶分子的检测；此外，在本发明的第四个方面中，额外地或可选地，可 通过对所述标签测序来进行该检测。
[0069] 在本发明的另一个优选方法中，所述样品选自包含以下样品的组：血液、血清、精 液、淋巴液、脑脊髓液、泪液、唾液、尿、排泄物、组织和汗。或者，样品可以是环境样品，例如 水、土壤或油。
[0070] 本领域技术人员将知道如何进行聚合酶链式反应（PCR)以扩增所述寡核苷酸。
[0071] 本领域技术人员还将理解，结合伴侣对于其对应物的特异性确保了测定的特异 性，并且因此消除了非特异性结合或背景噪声，此外，这还确保了低浓度下以及分子信号的 尺寸很小时的特异性结合。这种与PCR扩增步骤偶联的特征确保了可检测小信号，并因此 显著提高了测定的灵敏度。更有利地，每种探针与标签的偶联确保了可迅速地实现测定的 结果，因此增加系统的效率并使其以高通量筛选。此外，在测定方法中使用多种探针使得能 够进行多重研宄，并因此使得能够确定多个样品中是否存在一个特定信号和/或单个样品 或多个样品中是否存在多种信号。
[0072] 根据本发明的另一个方面，提供了用于检测至少一个样品中的至少一种靶分子的 试剂盒，其包含：根据本发明的至少一种探针或探针的文库，任选地，用于聚合酶链式反应 (PCR)扩增所述探针和/或对所述探针测序的至少一种引物对，和/或所述试剂盒相关的试 剂或说明书。
[0073] 本领域技术人员将理解，对于所涉及的探针，本发明包括：
[0074] 1)连接不能扩增的特异性结合伴侣（P =肽或蛋白质）与可扩增的分子（0 =寡核 苷酸）；
[0075] 2)在0中特异性并入独特的鉴定物或条形码（BC)区，使得可在单个测定/管中使 用大量P-O探针；并且理想地
[0076] 3)在所述寡核苷酸的一个或全部两个扩增引物区中并入鉴定标签，其允许在单个 高通量大规模平行测序反应中进行多个样品的处理。
[0077] 本领域技术人员还将理解，可通过建立对特定查询或研宄系具有特异性的探针文 库来有利地进行本发明。因此，例如，可建立包含被设计为检测所选病原体（例如细菌和病 毒）之探针的文库，更有利地建立包含被设计为检测所述病原体免疫显性表位之探针的文 库。更特别地，可建立探针文库以检测已知引起特定疾病的病原体，例如但不限于人脑炎或 呼吸道疾病。事实上，可建立包含例如覆盖大部分呼吸道疾病的100-150种P-O探针的探 针文库。另外，可建立探针文库以进行血清学检测，从