自动化酵母出芽测量的制作方法
【专利说明】
[0001] 优先要求权和相关专利申请
[0002] 本申请要求2012年10月18日提交的美国临时申请系列No. 61/715,496的优先 权利益，所述临时申请的全部内容作为整体通过参考并入本文。
技术领域
[0003] 本发明总的来说涉及酵母细胞的分析和测量。更具体来说，本发明涉及用于评估 和测量酵母细胞的酵母出芽、活性（viability)和浓度的高效且有效的方法和组合物。
【背景技术】
[0004] 生物燃料和酿造工业一直利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作为主要 生物体来开始生产CO2和生物乙醇作为产物的发酵过程。目前，最大的生物燃料过程严重 依赖于乙醇生产，其利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)对甘鹿、玉米粉、多糖和废 水进行发酵。由于它们的高的乙醇耐受性、最终乙醇浓度、葡萄糖转化率和工业发酵在历 史上的稳健性（historical robustness)，酵母是用于生物乙醇生产的理想组分。（Antoni 等，2007Appl. Microbiol. Biotech, vol. 77, ρρ· 23-35 ;Vert6s 等，2008J. Mol. Microbiol, and Biotech, vol. 15, pp. 16-30 ;Basso 等，2008FEMS Yeast Res. vol. 8, pp. 1155-1163; Nikoli0 等，2009J. Chem. Technolog· Biotech, vol. 84, pp. 497-503 ;Gibbons 等，2009In Vitro Cell. &Developm. Biol. -Plant, vol. 45, pp. 218-228 ;Hu 等，2007Genetics，vol. 175, pp. 1479-1487 ;Argueso 等，2009Genome Res. vol. 19, pp. 2258-2270 ;Eksteen 等， 2003Biotech. and Bioeng.vol. 84, pp. 639-646〇 )
[0005] 酵母出芽是酿酒厂和生物燃料公司用于确定发酵质量的最重要的参数之一。用 于繁殖和发酵的酵母接种时间（pitching time)是样品中出芽酵母的百分率，已知其能 够估算酵母的生长率。目前，没有现有的简单的自动酵母出芽检测方法。成像流式细胞仪 已被用于进行酵母细胞周期测定以测量出芽百分率。（Meredith等，2008Cytometry Part A，73A:825-833。）然而，成像流式细胞仪相对昂贵并且需要相当大量的维护以及训练有素 的技术人员进行操作。因此，它不适合于工业生产背景中的质量保证。此外，由于样品中大 的玉米糖化醪残渣会堵塞系统中的流体通路，因此基于流动的样品制备不能用于生物燃料 样品。
[0006] 用于浓度、活性和酵母出芽百分率的常规分析方法包括在常规光学显微镜下在血 细胞计数器中对酵母颗粒进行手动计数和在铺板中对菌落形成单位进行菌落计数。这些方 法是繁琐和耗时的，并且由于操作人员的主观性而固有地不一致。为了获得在发酵期间酵 母行为的准确体现，需要用于测量样品的浓度、活性和出芽百分率的自动方法。
[0007] 因此，对用于准确且高效测量酵母的浓度、活性和出芽百分率的自动方法，存在着 未满足的需求。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明部分是基于用于自动测量酵母出芽百分率的高效和有效方法的发现。本发 明克服了以前方法的缺点，通过本发明的方法可以容易地并准确地分析例如来自于生物燃 料和葡萄酒生产厂的实时样品。由于本发明允许高的染色特异性，因此可以有效地测量混 杂的样品。由于允许快速、准确和同时测定酵母出芽、浓度和活性，本发明的自动的、基于图 像的细胞计量方法极大简化了生物燃料和酿造工业的测量过程。
[0010] 一方面，本发明总的来说涉及一种用于自动分析酵母细胞的出芽状态的方法。所 述方法包括：在缓冲溶液中用染料对将要进行酵母细胞出芽分析的样品进行染色；获取所 述染料染色的样品的荧光图像；通过基于计算机的自动化处理分析所述染料染色的样品的 所述荧光图像，以确定所述染料染色的样品中酵母细胞的图像的纵横比，由此确定所述样 品中出芽的酵母细胞的状态。
[0011] 另一方面，本发明总的来说涉及一种用于同时测定酵母出芽和活性的方法。所述 方法包括：将待测样品在缓冲溶液中用第一染料并用第二染料进行染色；获取用所述第一 和第二染料染色的样品的第一荧光图像，该第一荧光图像对应于来自于所述第一染料的荧 光；获取用所述第一和第二染料染色的样品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自 于所述第二染料的荧光；通过基于计算机的自动化处理分析所述第一荧光图像以确定酵母 细胞的纵横比，由此确定所述样品中出芽的酵母细胞的状态；以及分析所述第二荧光图像 以确定酵母活性。
[0012] 另一方面，本发明总的来说涉及一种用于同时测量样品中酵母细胞的浓度、活性、 出芽百分率的方法。所述方法包括：将待测样品在具有约5至约12的pH的缓冲条件下用第 一染料并用第二染料进行染色；获取用所述第一和第二染料染色的样品的第一荧光图像， 该第一荧光图像对应于来自于所述第一染料的荧光；获取用所述第一和第二染料染色的样 品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自于所述第二染料的荧光；以及分析所述第 一和第二荧光图像，以确定酵母细胞的浓度、活性和出芽百分率。
[0013] 附图简述
[0014] 图1描绘了来自于本发明的方法的实施例的某些示例性结果，示出了用于对出芽 酵母进行计数的成像分析方法。
[0015] 图2描绘了来自于本发明的方法的实施例的某些示例性结果，示出了从正在生长 的酵母群体测量的出芽百分率。
[0016] 图3描绘了来自于本发明的方法的实施例的某些示例性结果，示出了与传统的手 动计数方法的比较。
[0017] 发明详述
[0018] 本发明解决了以前方法的缺点，并提供了对各种不同样品例如来自于生物燃料厂 的含有玉米糖化醪和其他残渣的样品的实时和准确的分析。由于高的染色特异性，因此可 以有效地测量混杂样品。通过允许同时分析和测量酵母细胞的活性和浓度，本发明还提供 了极高的效率和有效性。
[0019] 最近，Nexcelom Bioscience (Lawrence，MA)开发了 一 种新的成像细胞 计量方法，其能够使用廉价的一次性计数板快速测量细胞浓度，仅需20μ1样品。 (Lai 等，2009J. Clin. Oncology vol. 27, PP. 1235-1242 ;Nott 等，2009J. Biol. Chem. vol. 284, pp. 15277-15288 ；Qiao 等，2009Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biol. vol. 29, pp. 1779-U139 ;Rounbehler 等，2009Cancer Res. vol. 69, pp. 547-553 ; Shanks 等，2009Appl. and Envir. Microbiol, vol. 75, ρρ· 5507-5513 ;Stengel 等，2009Endo crinology, vol. 150, pp. 232-238〇 )
[0020] 利用明场和荧光成像的结合，所述系统能够自动获取细胞图像并使用新的计数算 法进行处理，以对细胞群体和各种不同细胞类型的活性进行的准确一致的测量。以前已报 道了多种应用，例如免疫细胞、癌细胞、干细胞、昆虫细胞、脂肪细胞、肝细胞、血小板、藻类 细胞和异质性细胞的计数，GFP转染的定量，使用台盼蓝或碘化丙啶的活性测定，测量全血 中的WBC。更重要的是，所述方法已被显示为产生一致的纯酵母的浓度和活性测量，在生物 燃料、饮料和烘焙业中用于质量控制。（Nexcelom Bioscience，"使用Oxonol简单、快速和 一致地测定酵母活性"（Simpe, Fast and Consistent Determination of Yeast Viability using Oxonol)，在 Application Focus:Cellometer Vision 10X, pp. 1-2 中）。
[0021] 本文中公开了 一种新的成像荧光细胞计量方法，其利用Cellometeru Vision (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)，用于在例如来自于运行中的发酵罐的玉米 糖化醪中确定酵母出芽、浓度和活性。使用本发明的稀释缓冲液并用吖啶橙（AO)和碘化丙