要求书中，单数形式"一（a) "、"一（an) "和"一（the) " 包含复数引用，除非上下文明确陈述并非如此。
[0046] 除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术 人员所通常理解的相同的意义。尽管与本文中所描述的相似或等同的任何方法和材料也可 用于本公开的实践或试验，但现在描述了优选的方法和材料。除了所公开的具体顺序之外， 本文中叙述的方法可以以任何逻辑上可能的顺序执行。
[0047] 通过参考并入
[0048] 在本公开中，对其他文献例如专利、专利申请、专利公开、杂志、书籍、论文、网页内 容进行了参考和引用。为任何目的，所有这样的文献在此作为整体通过参考并入本文。被称 为通过参考并入本文，但是与现有的定义、陈述或本文中专门提出的其他公开材料冲突的 任何材料或其部分，仅以不在并入的材料与本公开的材料之间产生冲突的程度上并入。在 有冲突的情况下，以支持作为优选公开内容的本公开的方式解决冲突。
[0049] 等同物
[0050] 本文中公开的代表性实例旨在帮助说明本发明，并且不打算、它们也不应被解释 为限制本发明的范围。事实上，对于本领域技术人员来说，根据本文件的全部内容、包括随 后的实例和对本文中引用的科学和专利文献的参考，除了本文中示出和描述的之外，本发 明的各种修改例及其许多进一步的实施例将变得显而易见。本文中的实例在其各种不同实 施例及其等同例中含有重要的附加信息、示例和指导，其可以适用于实践本发明。
【主权项】
1. 一种用于酵母细胞的出芽状态的自动化分析的方法，所述方法包括： 在缓冲溶液中用染料对将要进行酵母细胞出芽分析的样品进行染色； 获取所述染料染色的样品的荧光图像； 通过基于计算机的自动化处理分析所述染料染色的样品的荧光图像，以确定所述染料 染色的样品中酵母细胞的图像的纵横比，由此确定所述样品中出芽的酵母细胞的状态。
2. 权利要求1的方法，其中所述基于计算机的自动化处理包括圆形出芽酵母的形状的 自动测量。
3. 权利要求2的方法，其中如果圆形酵母细胞的纵横比为I. 1以上，则它被认为是出芽 的。
4. 权利要求1的方法，其中所述染料选自由吖啶橙、SYTO 9、0八?1、11〇6(*5^、钙荧光白、 碘化丙啶、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS、吖啶黄、ConA-FITC所组成的组。
5. 权利要求1的方法，其中所述缓冲条件具有约5至约12的pH。
6. 权利要求5的方法，其中所述缓冲条件具有约8至约12的pH。
7. 权利要求1的方法，其中所述待测样品是来自于使用酵母的醇类生产过程的样品。
8. 权利要求1的方法，其中所述待测样品是来自于生物燃料发酵过程的样品。
9. 权利要求8的方法，其中所述待测样品包含玉米糖化醪的残渣。
10. 权利要求8的方法，其中所述待测样品包含甘蔗、纤维素和玉米秸的一种以上残 渣。
11. 权利要求8的方法，其中所述生物燃料发酵过程包括从生物质生产乙醇。
12. 权利要求8的方法，其中所述生物燃料包括从生物质生产丁醇。
13. 权利要求8的方法，其中所述生物燃料包括从生物质生产甲醇。
14. 权利要求1的方法，其中所述待测样品是来自于葡萄酒生产过程的样品。
15. 权利要求1的方法，其中所述待测样品是来自于啤酒酿造生产过程的样品。
16. 权利要求1的方法，其中所述酵母是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)种类。
17. 权利要求4的方法，其中所述染料是浓度为约I y g/mL至约50 y g/mL的吖啶橙。
18. -种用于同时确定酵母出芽和活性的方法，所述方法包括： 将待测样品在缓冲溶液中用第一染料并用第二染料进行染色； 获取用所述第一和第二染料染色的样品的第一荧光图像，该第一荧光图像对应于来自 于所述第一染料的荧光； 获取用所述第一和第二染料染色的样品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自 于所述第二染料的荧光； 通过基于计算机的自动化处理分析所述第一荧光图像以确定酵母细胞的纵横比，由此 确定所述样品中出芽的酵母细胞的状态；以及 分析所述第二荧光图像以确定酵母的活性。
19. 权利要求18的方法，其中所述基于计算机的自动化处理包括图像分析以测量出芽 的酵母的形状。
20. 权利要求18的方法，其中如果酵母细胞的图像的纵横比为I. 1以上，则它被认为是 出芽的。
21. 权利要求18的方法，其中所述第一染料选自由吖啶橙、SYTO 9、DAPI、Hoechst、钙 荧光白所组成的组，并且所述第二染料选自由碘化丙啶、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS所组成 的组。
22. 权利要求21的方法，其中所述第一染料是吖啶橙并且所述第二染料是碘化丙啶。
23. 权利要求18的方法，其中所述缓冲条件具有约5至约12的pH。
24. 权利要求23的方法，其中所述缓冲条件具有约8至约12的pH。
25. 权利要求18的方法，其中所述待测样品是来自于生物燃料发酵过程的样品。
26. 权利要求25的方法，其中所述生物燃料发酵过程包括生产乙醇。
27. 权利要求25的方法，其中所述生物燃料发酵过程包括生产丁醇。
28. 权利要求25的方法，其中所述生物燃料发酵过程包括生产甲醇。
29. 权利要求25的方法，其中所述待测样品包含玉米糖化醪的残渣。
30. 权利要求25的方法，其中所述待测样品包含甘蔗的残渣。
31. 权利要求18的方法，其中所述将要进行酵母出芽和活性试验的样品是来自于葡萄 酒生产过程的样品。
32. 权利要求18的方法，其中所述待测样品是来自于啤酒酿造生产过程的样品。
33. 权利要求18的方法，其中所述酵母是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)种 类。
34. 权利要求22的方法，其中吖啶橙具有约I y g/mL至约50 y g/mL的浓度，并且碘化 丙啶具有约I U g/mL至约50 y g/mL的浓度。
35. 权利要求18的方法，其还包括分析所述第一和第二荧光图像以确定出芽的酵母细 胞的浓度。
36. -种用于同时测量样品中酵母细胞的浓度、活性、出芽百分率的方法，所述方法包 括： 在具有约5至约12的pH的缓冲条件下，将待测样品用第一染料并用第二染料进行染 色； 获取用所述第一和第二染料染色的样品的第一荧光图像，该第一荧光图像对应于来自 于所述第一染料的荧光； 获取用所述第一和第二染料染色的样品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自 于所述第二染料的荧光；以及 分析所述第一和第二荧光图像，以确定酵母细胞的浓度、活性和出芽百分率。
37. 权利要求36的方法，其中所述第一染料选自由吖啶橙、SYTO 9、DAPI、Hoechst、钙 荧光白所组成的组，并且所述第二染料选自由碘化丙啶、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS所组成 的组。
38. 权利要求37的方法，其中所述第一染料是吖啶橙并且所述第二染料是碘化丙啶。
39. 权利要求36的方法，其中所述缓冲条件具有约8至约12的pH。
40. 权利要求39的方法，其中所述缓冲条件具有约8至约12的pH。
41. 权利要求36的方法，其中所述样品来自于生物燃料发酵过程。
42. 权利要求41的方法，其中所述样品包含玉米糖化醪的残渣。
43. 权利要求41的方法，其中所述样品包含甘蔗、纤维素和玉米秸的一种以上残渣。
44. 权利要求36的方法，其中所述样品来自于葡萄酒生产过程。
45. 权利要求36的方法，其中所述样品来自于啤酒酿造生产过程。
46. 权利要求36的方法，其中所述酵母是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)种 类。
【专利摘要】本发明总的来说涉及分析酵母的活性和酵母的繁殖率。更具体来说，本发明涉及用于评估和测量酵母细胞的出芽百分率、活性和浓度的高效且有效的方法和组合物。
【IPC分类】C12Q1-02, C12N1-16, G01N21-64
【公开号】CN104812910
【申请号】CN201380054564
【发明人】利奥·L·陈, 让·裘, 彼得·李, 凯文·弗拉纳根
【申请人】奈克塞勒姆生物科技有限责任公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2013年10月9日
【公告号】EP2909330A1, US20150232906, WO2014062431A1