啶（PI)染色样品，出芽状态、活性和失活的酵母被选择性标记，同时消除了来自于玉米糖 化醪的非特异性荧光信号。这种方法可以使用直接来自于加工中的发酵罐的样品，不需进 一步的过滤处理，高效地进行酵母质量控制，这可能对在美国监测一致的生物乙醇生产具 有巨大影响。除了玉米糖化醪之外，使用这种方法也可以测量甘蔗发酵中酵母的活性。所 述方法也可以容易地应用于酿造生产过程中的质量控制。
[0022] 如图1中所示，本发明利用了一种包括自动显微术、荧光染色和缓冲液以及图像 分析方法的系统。本发明的图像分析方面利用荧光染色的酵母的获取的图像，并测量每个 酵母颗粒的长轴和短轴长度。长轴与短轴长度之比，在本文中被定义为"斜率=长轴/短 轴"，提供了可以藉以评估酵母的出芽状态的变量（参数）。例如，如果酵母颗粒正在出芽， 则长轴长度将大于短轴长度，因此产生大于1的斜率值，而如果酵母颗粒不在出芽，则对于 圆形酵母来说斜率具有约为1的值。使用这个参数，人们可以自动将图2中的第二群体设 门（gate)为出芽群体。
[0023] 一方面，本发明总的来说涉及一种用于自动分析酵母细胞的出芽状态的方法。所 述方法包括：在缓冲溶液中用染料对将要进行酵母细胞出芽分析的样品进行染色；获取染 料染色的样品的荧光图像；通过基于计算机的自动化处理分析染料染色的样品的荧光图 像，以确定染料染色的样品中酵母细胞的图像的纵横比，由此确定样品中出芽的酵母细胞 的状态。
[0024] 在某些优选实施例中，基于计算机的自动化处理包括自动测量样品中出芽的酵母 的形状。可以设定阈值，使得如果酵母细胞（通常为圆形）的纵横比为1. 1以上，则将它当 作出芽的。取决于应用，可以设定其他阈值，例如1. 15以上、1. 2以上、1. 25以上的纵横比 等。
[0025] 所述染料可以是适合于染色和分析的任何染料，例如选自由吖啶橙、SYTO 9、 DAPI、Hoechst、妈焚光白、碘化丙啶、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS、卩丫啶黄、ConA-FITC所组成 的组中的一种以上染料。使用的染料量/浓度取决于具体的应用。例如在吖啶橙的情形 中，浓度可以在约I μ g/mL至约50 μ g/mL(例如约2 μ g/mL至约50 μ g/mL、约5 μ g/mL至 约 50 μ g/mL、约 10 μ g/mL 至约 50 μ g/mL、约 20 μ g/mL 至约 50 μ g/mL、约 25 μ g/mL 至约 50 μ g/mL、约 1 μ g/mL 至约 40 μ g/mL、约 1 μ g/mL 至约 30 μ g/mL、约 1 μ g/mL 至约 20 μ g/ mL、约1 μ g/mL至约10 μ g/mL)的范围内。
[0026] 缓冲液可以是任何适合的缓冲溶液，例如具有约5至约12范围内（例如约6至约 12、约7至约12、约8至约12范围内，约8、9、10、11或12)的pH的缓冲液。
[0027] 通过本文公开的方法可以分析任何适合的样品。例如，样品可以是来自于使用酵 母的醇类生产过程的样品。在某些实施例中，待测样品是来自于生物燃料发酵过程的样品。 待测样品可能含有某些残渣，例如玉米糖化醪、甘蔗、纤维素和玉米秸中的一种以上残渣。
[0028] 本发明的方法适合于分析和测量来自于从生物质生产乙醇、丁醇和甲醇中的一种 以上的生物燃料发酵过程的样品。
[0029] 适合于通过所公开的方法分析的样品的其他实例，包括来自于葡萄酒生产过程的 样品。
[0030] 所述方法普遍适用于测量一般酵母的出芽状态。酵母的示例性种类包括酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)〇
[0031] 另一方面，本发明总的来说涉及一种用于同时确定酵母出芽和活性的方法。所述 方法包括：将待测样品在缓冲溶液中用第一染料并用第二染料进行染色；获取用第一和第 二染料染色的样品的第一荧光图像，该第一荧光图像对应于来自于第一染料的荧光；获取 用第一和第二染料染色的样品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自于第二染料的 荧光；通过基于计算机的自动化处理分析第一荧光图像以确定酵母细胞的纵横比，由此确 定样品中出芽的酵母细胞的状态；以及分析第二荧光图像以确定酵母活性。该方法还可以 包括分析第一和第二荧光图像以确定出芽的酵母细胞的浓度的步骤。
[0032] 例如，在卩丫啶橙的情况下，浓度可以在约1 μ g/mL至约50 μ g/mL (例如约2 μ g/mL 至约 50 μ g/mL、约 5 μ g/mL 至约 50 μ g/mL、约 10 μ g/mL 至约 50 μ g/mL、约 20 μ g/mL 至约 50 μ g/mL、约 25 μ g/mL 至约 50 μ g/mL、约 1 μ g/mL 至约 40 μ g/mL、约 1 μ g/mL 至约 30 μ g/ mL、约1 μ g/mL至约20 μ g/mL、约1 μ g/mL至约10 μ g/mL)的范围内。此外，例如在碘化丙啶 的情况下，浓度可以在约I U g/mL至约50 μ g/mL(例如约2 μ g/mL至约50 μ g/mL、约5 μ g/ mL 至约 50 μ g/mL、约 10 μ g/mL 至约 50 μ g/mL、约 20 μ g/mL 至约 50 μ g/mL、约 25 μ g/mL 至 约 50 μ g/mL、约 I μ g/mL 至约 40 μ g/mL、约 I μ g/mL 至约 30 μ g/mL、约 I μ g/mL 至约 20 μ g/ mL、约1 μ g/mL至约10 μ g/mL)的范围内。
[0033] 在某些实施例中，第一染料选自由吖啶橙、SYTO 9、DAPI、Hoechst、钙荧光白所组 成的组，并且第二染料选自由碘化丙啶、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS所组成的组。在某些优 选实施例中，第一染料是吖啶橙并且第二染料是碘化丙啶。
[0034] 在另一方面，本发明总的来说涉及一种用于同时测量样品中酵母细胞的浓度、活 性、出芽百分率的方法。该方法包括：将待测样品在具有约5至约12的pH的缓冲条件下用 第一染料并用第二染料进行染色；获取用第一和第二染料染色的样品的第一荧光图像，该 第一荧光图像对应于来自于第一染料的荧光；获取用第一和第二染料染色的样品的第二荧 光图像，该第二荧光图像对应于来自于第二染料的荧光；以及分析第一和第二荧光图像，以 确定酵母细胞的浓度、活性和出芽百分率。
[0035] 所开发的自动酵母出芽检测方法可以应用于大量类型的酵母。可以调整测量的斜 率参数以能够固定对芽的大小的限制，以消除不同技术人员之间的主观性。本公开的方法 快速且简单，并且可以容易地适应于酿造和生物燃料工业的生产或研宄部门处的质量保证 环境。本公开的发明的更加独特之处在于可以同时测量所有三个重要参数（酵母浓度、活 性和出芽百分率）。 实施例
[0036] 酵母制备
[0037] 通过将酵母在3〇°c下在Yro培养基中过夜温育来制备酵母生长培养物。然后通过 在30°C下振荡，将酵母培养物（800 μ?重悬浮在20mL培养基玻璃试管中。在2. 5、5、6、8、 10、24和30小时的时间点收集酵母并用吖啶橙和碘化丙啶染色。获取荧光图像。
[0038] 自动检测
[0039] 在每个时间点，使用 Cell Profiler (Cambridge，MA)和 Nexcelom Cellometer 软件（Lawrence，MA)分析焚光图像，其中将输出的数据输入到FCS Express 4Image(Los Angeles，CA)中。然后使用FCS Express 4对每个酵母颗粒的斜率进行作图，以便分开并 测量两个群体（出芽和不出芽的）（图1)。这种方法被并入Cellomelerk软件中，以便使用 斜率值来确定出芽百分率，并同时测量浓度和活性。
[0040] 手动比较
[0041] 在每个时间点，在明场成像和荧光成像下进行酵母颗粒和出芽的手动计数。对总 酵母颗粒和出芽的酵母进行手动计数以产生样品中的出芽百分率。判定标准目前被设定为 如果两个酵母相接触，则它被计数为一个芽。将手动计数的结果与自动检测方法进行比较。
[0042] 自动方法的验证
[0043] 自动出芽检测方法在每个时间点处的设门结果示出在图3中。存在清楚的趋势， 即在生长阶段开始时，观察到高的出芽百分率。随后从延滞期、对数期到稳定期，出芽百分 率降低。在生长期中，出芽百分率从~60降低至20%。
[0044] 将自动出芽结果与明场和荧光手动计数进行比较（图3)。结果显示出在所有三种 方法之间测量到可比的出芽百分率。由于将碎片计数，明场手动计数通常过高估计出芽，而 荧光手动计数方法与自动方法保持相对一致。
[0045] 在本说明书和随附的权利