一种检测抵抗素的试剂盒及其制备方法和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫分析领域，特别是设及一种检测抵抗素的试剂盒及其制备方法和 检测方法。
【背景技术】
[0002] 抵抗素（resisting,RST)是2001年发现的一种白色脂肪细胞特异表达和分泌 的激素蛋白。因它有降低膜岛素敏感性的作用，故将其命名为抵抗素，它属于抵抗素样分 子家族（resistin-likemolecules,RELMs)分泌型蛋白质家族成员。人类抵抗素是一种 12. 5kDa的蛋白质，其前体含有108个氨基酸，其在人体内细胞中合成后，被分泌到血液中。 抵抗素具有类似炎症因子的蛋白分子结构，与单核巨瞻细胞的功能有关，能影响多形核白 细胞的趋化运动和氧化爆发，导致患者免疫功能素乱，在免疫炎症反应中发挥重要作用，此 夕F，有研究显示，且抵抗素水平与体重指数和内脏脂肪含量正相关，通常情况下通过检测抵 抗素的水平来检测脂肪在人体内的沉积情况。
[000引在正常情况下，其在人体血液中的含量很低，一般小于14ng/mU而在消化性溃瘍 急性穿孔患者、溃瘍性结肠炎或肥胖患者血液中抵抗素的水平较高，约为l00-3(K)ng/ml。通 过检测W急症腹痛为主诉的患者血清中抵抗素的水平可W实现对消化性溃瘍急性穿孔、溃 瘍性结肠炎及肥胖等疾病的早期诊断和排查，为该类疾病的诊断治疗提供数据支撑。
[0004] 目前，检测抵抗素的方法主要有胶乳增强免疫比浊法、酶联免疫吸附试验巧LISA) 等。胶乳增强免疫比浊法存在检测线性范围窄、阳性率低等缺点；ELISA法存在灵敏度低、 线性范围窄、不易实现全自动化等缺陷；从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断 和科研工作。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。
【发明内容】
[0005] 发明目的；本发明的第一个目的是提供一种检测抵抗素的定量检测试剂盒，具有 简便、快速、灵敏度高、线性范围宽和稳定性好等优点，W克服现有技术的不足。
[0006] 本发明的第二个目的是提供了上述检测抵抗素的试剂盒的制备方法和检测方法。
[0007] 本发明的第S个目的是提供了检测抵抗素的试剂盒的检测方法。
[000引本发明采用化学发光免疫分析技术对人血清中抵抗素的水平进行定量检测，实现 对消化性溃瘍急性穿孔、溃瘍性结肠炎及肥胖等疾病的早期诊断和排查。
[0009] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测抵抗素的试剂盒，所 述试剂盒包括抗异硫氯酸巧光素多克隆抗体包被的磁微粒，异硫氯酸巧光素标记的抵抗素 单克隆抗体，碱性磯酸酶标记的抵抗素单克隆抗体和碱性磯酸酶催化发光的化学发光底物 液。
[0010] 作为优选，所述试剂盒还包括用于稀释所述抗异硫氯酸巧光素多克隆抗体包被的 磁微粒、异硫氯酸巧光素标记的抵抗素单克隆抗体和碱性磯酸酶标记的抵抗素单克隆抗体 的稀释液，所述稀释液为抑值为7. 5~8. 5、含质量比为0. 3~0. 7%的牛血清白蛋白BSA 和0.05~0.3%的叠氮化钢防腐剂NaN3的0.05~0.2MTris-HCl缓冲液。
[0011] 作为优选，所述抗异硫氯酸巧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于稀释液中，配 制成0. 5~2yg/mL的磁微粒溶液。
[0012] 在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了 检测灵敏度和准确性，所W从复杂的待测样品基质中快速分离、纯化出目的待测物是临床 检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的 磁性固相微粒作载体，W物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗 原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细 胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些 特殊成分得W分离、浓集或纯化。作为优选，所述磁微粒为0. 7~3ym粒径、四氧化=铁内 核、表面包裹有活性基团的聚合物。优选地，所述活性基团为駿基。
[0013] 作为优选，所述异硫氯酸巧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中，配制 成0. 25~0. 5yg/mL异硫氯酸巧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
[0014] 作为优选，所述碱性磯酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中，配制成 0. 25~0. 5yg/mL碱性磯酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
[0015] 作为优选，所述化学发光底物液是0. 1~0. 3M，pH值为8~10的Tris-HCl缓冲 液，并含有0. 2~0. 4mg/mL的二氧杂环己烧。
[0016] 更为优选的是，所述化学发光底物液是0. 2M，抑值为9. 3的Tris-HCl缓冲液，并 含有0. 3mg/mL的二氧杂环己烧。
[0017] 作为优选，所述试剂盒还包括清洗液，所述清洗液为0. 1~0. 2M，抑值为8~9的 Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0. 01~0. 04%的吐温20和15~20%的氯化钢。
[0018] 更为优选的是，所述清洗液为0. 1M，抑值为8的Tris-HCl缓冲液中加入质量百 分比为0. 02%的吐温20和15%的氯化钢。
[0019] 作为优选，所述试剂盒还包括抵抗素系列校准品，所述校准品浓度范围为0~ 50ng/mL。
[0020] 作为优选，本发明提供的试剂盒还包括反应试管，其材料选自透明的聚苯己締、聚 己締和聚丙締中的至少一种。
[0021] 本发明提供的试剂盒的检测原理为；将待测样本，FITC标记的抵抗素单克隆抗体 溶液和ALP标记的抵抗素单克隆抗体溶液混合温育，巧光素（FITC)和碱性磯酸酶（AL巧标 记的一对抗抵抗素单克隆抗体与样本中抵抗素抗原分子结合，形成免疫复合物。然后加入 包被有抗FITC多克隆抗体的磁微粒，免疫复合物被吸附到磁微粒表面。洗漆去除未结合的 抗体和杂质后加入发光底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强度（RLU)。在一定范围内 RLU与抵抗素抗原浓度呈正比，通过内插法就可W从标准曲线上读取待测样本的抵抗素含 量。
[0022] 一种检测抵抗素的试剂盒的检测方法，包括W下步骤：
[0023] 1)将试剂盒中的试剂从储存条件下取出后应平衡到室温再用于检测；使用前将 抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀；用去离子水将清洗 液稀释，混匀；设定好37°C水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；根据需要准备试管并做 好标记；
[0024] 2)加校准品和待测样本至对应试管中，加FITC标记的抵抗素单克隆抗体溶液和 ALP标记的抵抗素单克隆抗体溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀，置37 + 0. 5°C水 浴，然后加入抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混 匀，置37 + 0. 5°C水浴，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀；用一大而缓 慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，拍击，W 除去沾在管壁上的液滴，加稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀；重复上 述清洗操作，共清洗3次；
[002引如加碱性磯酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀，在5分钟内用 发光检测仪进行检测，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，再根 据待测样本的相对发光强度可W从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。
[0026] 有益效果；本发明提供的检测抵抗素的试剂盒采用双抗体夹屯、法的反应模式，有 效地利用了化学发光检测技术结合磁微粒免疫分离技术原理，定量测定人体血样品中的抵 抗素含量，确保了检测的灵敏度，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。而且， 对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单可靠，可快速、高通量检测大批样品，便于操 作和生产。本发明提供的试剂盒结构简便，使用方便，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操 作简单，试剂盒成本低，无放射性污染，临床适用性强，更适用于我国临床检测，适合在国内 的各级医院推广使用。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明实施例试剂盒中抵抗素的浓度一发光值曲线图；
[002引图2为本发明实施例A，B点连点拟合曲线图（单位；ng/ml)。
[0029]
【具体实施方式】
[0030] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，W下结合具体实施例，并参照 附图，对本发明进一步详细说明。
[0031] 实施例1检测抵抗素的试剂盒的制备
[0032] 一、抵抗素校准品的制备
[003引用抑=7. 5,0. 1MTris-HCl缓冲液将抵抗素纯品稀释成6个水平的冻干校准品， 用纯水复溶后的目标浓度分别为0、0.25、2、10、25和50ng/ml。其中，所述抵抗素校准品的 原料为标准级，纯度不低于99 %。
[0034] 二、抗异硫氯酸巧光素（FITC)多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备
[0035] 将粒径为1ym的磁微粒加磁场，静置15min，倒出上清液，用抑=4. 7的25mM的 MES缓冲液清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮，浓度为50mg/mL;每血悬浮液中加入抗FITC 多克隆抗体2mg，在室温条件下混合均匀；用去离子水配制浓度为lOmg/mL的l-(3-二甲 氨基丙基）-3-己基碳二亚胺巧DC)溶液，每血磁微粒悬浮液中加入ImL浓度为lOmg/mL 的邸C溶液，在室温条件下揽拌反应4小时后得到包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒；然后 加磁场，静置15min，倒出上清液，用抑=8. 0,含质量比为0. 5%的牛血清白蛋白炬SA)和 0. 2%的叠氮化钢防腐剂的0. 1MTris-HCl缓冲液清洗4次，并用该缓冲液将包被抗FITC 多克隆抗体的磁微粒配制成1yg/mL的工作液。该包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒溶液 在4°C保存，不应冻存，用时混匀。磁微粒为0. 7ym粒径、四氧化=铁内核、表面包裹有活性 基团的聚合物；活性基团为駿基。
[0036]=、异硫氯酸巧光素（FITC)标记的抵抗素单克隆抗体溶液的制备
[0037] 将抵抗素单克隆抗体置于透析袋，在用0. 2MpH=9. 0的碳酸盐缓冲液中过夜透 析；用0. 2M抑=9. 0的Na肥〇3溶液配制浓度为0. 5mg/mL的FITC溶液，每mg抵抗素单 克隆抗体加入0. 15mL浓度为0. 5mg/mL的FITC溶液，混合均匀，室温下反应20小时后，在 0. 2MpH=9. 0的碳酸盐缓冲液中过夜透析，即得到异硫氯酸巧光素标记的抵抗素单克隆 抗体；用含有质量百分含量为0. 5%的牛血清白蛋白和质量百分含量为0. 2%的叠氮化钢 防腐剂的0. 1M Tris-HCl缓冲液稀释异硫氯酸巧光素标记的抵抗素单克隆抗体，得到浓度 为0. 5 y g/mL的异硫氯酸巧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
[003引四、碱性磯酸酶（AL巧标记的抵抗素单克隆抗