体溶液的制备
[0039] 用去离子水配制14.OOmg/mL的2-亚氨基硫哲烧盐酸盐溶液，取抵抗素单克隆抗 体预先装在尖底试管里，加入14.OOmg/mL的2-亚氨基硫哲烧盐酸盐溶液（加入量为抗体 体积1/100)，混匀，在室温下放置30分钟，即得活化后的抵抗素单克隆抗体。
[0040] 取碱性磯酸酶预先装在尖底试管里（碱性磯酸酶与抵抗素单克隆抗体的质量比 为1:1)，用无水二甲基甲酯胺配制6. 69mg/mL的Sulfo-SMCC溶液，在含有碱性磯酸酶的试 管中加入Sulfo-SMCC溶液（加入量为ALP体积1/20)，混匀，在室温下放置15分钟，即得活 化后的碱性磯酸酶溶液。
[004U在上述活化后的抵抗素单克隆抗体中加入1M的MgCl2溶液（加入量为抗体体积 1/500)，再继续加入活化后的碱性磯酸酶溶液，将试管放在4°C条件下14~16小时，即得碱 性磯酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶液。
[004引安装蛋白质纯化系统（AKTApurifierlOO)，使用Superdex200制备级16/70(或相 近）柱子，使用抑=7. 0去离子水配制的质量百分浓度为2 %的立己醇胺溶液进行平衡，流 速Iml/min，收集各洗脱峰流分，测定各洗脱峰流分的280nm处吸光值，收集280nm处吸光值 大于0. 02的管份，计算碱性磯酸酶标记的抵抗素单克隆抗体的浓度。用含有质量百分浓度 为0. 5%的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0. 2%的叠氮化钢防腐剂的0. 1MTris-HCl缓 冲液稀释该碱性磯酸酶标记的抵抗素单克隆抗体，得到浓度为0. 5yg/mL的碱性磯酸酶标 记的抵抗素单克隆抗体溶液。
[0043] 五、碱性磯酸酶催化发光的化学发光底物液的制备
[0044] 用0. 2MpH= 9. 3的Tris-HCl缓冲液配制二氧杂环己烧化合物（APCL)终浓度为 0. 3mg/mL的溶液。
[0045] 六、清洗液的配制
[0046] 向0. 1M、抑=8. 0的Tris-肥1缓冲液中加入吐温20和氯化钢，其中，吐温20的 质量百分浓度为0. 02%，氯化钢的质量百分浓度为15% ;
[0047] 走、将用上述方法制备的各组分检验合格后组装成试剂盒，组装成试剂盒后需要 抽检合格后才能出厂。
[0048] 实施例2 ;检测抵抗素的试剂盒的制备
[0049] 与实施例1基本一样，所不同的是，抗异硫氯酸巧光素多克隆抗体包被的磁微粒 悬浮于稀释液配制成0. 5yg/mL的磁微粒溶液；异硫氯酸巧光素标记的抵抗素单克隆抗 体溶解在稀释液中配制成0. 25yg/血异硫氯酸巧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液；碱 性磯酸酶标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0. 25yg/mL碱性磯酸酶标记的 抵抗素单克隆抗体溶液；化学发光底物液是0. 1M，抑值为10的Tris-HCl缓冲液，并含有 0. 2mg/mL的二氧杂环己烧；清洗液为0. 2M，抑值为9的Tris-肥1缓冲液中加入质量百分 比为0. 01 %的吐温20和20%的氯化钢。磁微粒为3ym粒径、四氧化=铁内核、表面包裹 有活性基团的聚合物；活性基团为駿基。
[0050] 实施例3检测抵抗素的试剂盒的制备
[0化1] 与实施例1基本一样，所不同的是，抗异硫氯酸巧光素多克隆抗体包被的磁微粒 悬浮于稀释液配制成2yg/mL的磁微粒溶液；异硫氯酸巧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶 解在稀释液中配制成0. 5yg/mL异硫氯酸巧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液；碱性磯酸 酶标记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0. 5yg/mL碱性磯酸酶标记的抵抗素 单克隆抗体溶液；化学发光底物液是0. 3M，抑值为8的Tris-HCl缓冲液，并含有0. 4mg/mL 的二氧杂环己烧；清洗液为0. 1M，抑值为8的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0. 04% 的吐温20和17%的氯化钢。磁微粒为1. 5ym粒径、四氧化=铁内核、表面包裹有活性基团 的聚合物；活性基团为駿基。
[0052] 实施例4本发明制备的试剂盒的检测
[0化3] 1、采样；取全血或血清1ml;
[0054] 2、样品检测；
[0055] 试剂盒中的试剂从储存条件下取出后应平衡到室温再用于检测；使用前将抗 FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀，但是不能使用磁力揽 拌器揽拌；清洗液：用去离子水将清洗液稀释15倍，混匀；设定好37°C水浴；使化学发光检 测仪处于待测状态；根据需要准备试管并做好标记。
[0化6] 加50y1校准品和待测样本至对应试管中，每个样品应更换移液器头避免交叉污 染。加50y1FITC标记的抵抗素单克隆抗体溶液和50yLALP标记的抵抗素单克隆抗体溶 液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀30秒（2000转/分），置37 + 0. 5°C水浴15min。 然后加入50y1抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混 匀30秒（2000转/分），置37 ±0. 5 °C水浴5分钟，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁 板接触，沉淀2分钟。用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同 分离器一起放在滤纸上，拍击，W除去沾在管壁上的液滴。加300y1稀释后的清洗液至每 一试管中，置多管混匀器振荡混匀30秒（2000转/分）。重复上述清洗操作，共清洗3次。 [0化7]加100y1碱性磯酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀3秒，在5 分钟内用发光检测仪进行检测。利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方 程，参见图1，再根据待测样本的相对发光强度（RLU)可W从回归曲线上返算出样本中待测 物的浓度。
[005引按照本领域中常规的制造及检定规程对本发明的试剂盒进行检定，结果如下：[0化9] 1、试剂盒精密度测定
[0060] 将本发明提供的试剂盒取两批，分别测定低、、中、高不同浓度（分别为25ng/ 1111、135叫/1111、180叫/1111)的血清，10孔平行测定，得出批内变异系数为4.24%、2.31%和 1. 94%。
[0061] 表1分析内精密度与精确度测试
[0062]
【主权项】
1. 一种检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗异硫氰酸荧光素多克隆 抗体包被的磁微粒，异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的抵抗素 单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。
2. 根据权利要求1所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用 于稀释所述抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒、异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单 克隆抗体和碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体的稀释液，所述稀释液为pH值为7. 5~ 8. 5、含质量比为0. 3~0. 7%的牛血清白蛋白BSA和0. 05~0. 3%的叠氮化钠防腐剂NaN3 的 0? 05 ~0? 2M Tris-HCl 缓冲液。
3. 根据权利要求2所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述抗异硫氰酸荧光素 多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于稀释液中，配制成〇. 5~2yg/mL的磁微粒溶液。
4. 根据权利要求2所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素标 记的抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中，配制成0. 25~0. 5yg/mL异硫氰酸荧光素标记 的抵抗素单克隆抗体溶液。
5. 根据权利要求2所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的 抵抗素单克隆抗体溶解在稀释液中，配制成〇. 25~0. 5yg/mL碱性磷酸酶标记的抵抗素 单克隆抗体溶液。
6. 根据权利要求1所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液是 0. 1~0. 3M，pH值为8~10的Tris-HCl缓冲液，并含有0. 2~0. 4mg/mL的二氧杂环乙 烷。
7. 根据权利要求1所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括清洗 液，所述清洗液为〇. 1~〇. 2M，pH值为8~9的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为 0. 01~0. 04%的吐温20和15~20%的氯化钠。
8. 根据权利要求1所述的检测抵抗素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抵抗 素系列校准品，所述校准品浓度范围为〇~50ng/mL。
9. 权利要求1~8任一项所述的一种检测抵抗素的试剂盒的制备方法，其特征在于，包 括以下步骤：1)抵抗素校准品的制备；2)抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒溶 液的制备；3)异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体溶液的制备；4)碱性磷酸酶标记的 抵抗素单克隆抗体溶液的制备；5)碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液的制备；6)清洗 液的配制；7)将用上述方法制备的各组分检验合格后组装成试剂盒。
10. 权利要求1~8任一项一种检测抵抗素的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下 步骤： 1) 将试剂盒中的试剂从储存条件下取出后应平衡到室温再用于检测；使用前将抗 FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀；用去离子水将清洗液 稀释，混匀；设定好37°C水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；根据需要准备试管并做好 标记； 2) 加校准品和待测样本至对应试管中，加FITC标记的抵抗素单克隆抗体溶液和ALP 标记的抵抗素单克隆抗体溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀，置37±0.5°C水浴， 然后加入抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀，置 37±0. 5°C水浴，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀；用一大而缓慢的圆 周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，拍击，以除去沾 在管壁上的液滴，加稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀；重复上述清洗 操作，共清洗3次； 3)加碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀，在5分钟内用发光 检测仪进行检测，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，再根据待 测样本的相对发光强度可以从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。
【专利摘要】本发明公开了一种检测抵抗素的试剂盒，包括：抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒，异硫氰酸荧光素标记的抵抗素单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的抵抗素单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。本发明提供的检测抵抗素的试剂盒采用双抗体夹心法的反应模式，有效地利用了化学发光检测技术结合磁微粒免疫分离技术原理，定量测定人体血清或血浆样品中的抵抗素含量，确保了检测的灵敏度，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104880564
【申请号】CN201510219441
【发明人】杨子学, 许佩佩
【申请人】南京格耀生物科技有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月30日