专利名称：微菌落分子信标培养结核菌诊断试剂盒及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明所属领域包括以下内容
(一) 分子生物学范畴。
(二) 细菌生物特征研究领域。
(三) 传染性疾病诊断医学研究领域。
二背景技术：
(一) 分子生物学本申请的主体是结核杆菌的分子信标探针。选择结核杆菌特有的序列
ropB, IS6110为耙序列设计引物和探针检测结核杆菌。
(二) 细菌生物特征研究通过结核杆菌的微菌落培养以后，证明接种的细菌是活菌。
(三) 传染性疾病诊断医学研究。
结核病俗称"肺痨"，是由结核杆菌侵入人体后引起的一种具有强烈传染性的慢性消耗性 疾病。近年来由于结核杆菌耐药性增强、人口流动增加、艾滋病发病率升高、以及有些国家 和地区忽视对结核病的控制，结核病有重薪抬头的趋势，再次成为危害人类健康的疾病之一。
据世界卫生组织估计，目前全世界约有20亿人受结核分枝杆菌感染，5000万人感染耐药 结核杆菌，每年有800万人新感染结核杆菌，300万人死于结核病。我国是世界上22个结核病 高负担国家之一，患者人数仅次于印度居全球第二位。世界卫生组织2004年召开的第二届全 球遏制结核病伙伴论坛大会上，将我国列在需要特别引起警示的国家和地区的首位。具体表 现为6 "多"感染人数多、患病人数多、新发患者多、死亡人数多、农村患者多、耐 药患者多。
目前常用的方法1.抗酸染色2.培养法3.分子生物学法。 为了克服抗酸染色特异性和敏感性低、传统培养耗时长，PCR方法存在假阳性、假阴性、产 物分析容易污染环境等缺点，探索建立一种微菌落培养法和分子信标检测法联合应用检测结 核杆菌的方法。
三
发明内容
(一)发明的特征
1、由于结核杆菌生长非常缓慢，大约需要12小时才能分裂一代，需要4-8周才能长出可见 菌落，不利于结核病的诊断和流行病学调査。为了达到快速检验的目的，本发明提供了一种用于快速检测生物样品中是否存在结核杆菌以及鉴定结核杆菌死活的方法。其特征是将结 核杆菌涂布于贴在结核杆菌选择性培养基上的醋酸纤维素膜上孵育，12-72小时，可借助于普 通光学显微镜观察到结核杆菌的微菌落形态。
2、 微菌落法看到形成微菌落以后，证明接种的细菌是活菌，但不能判断是否是结核分枝杆菌
为此本发明提供了一种具有高特异性、高灵敏度的用于结核杆菌检测的分子信标探针。其特
征是选择结核杆菌特有的序列r叩B,IS6110为靶序列设计引物(具有序列表〈210〉 3，序列 表〈210〉 4，序列表〈210〉6，序列表<210> 7的多核苷酸序列)和双重探针(具有序列表〈210〉5， 序列表〈210> 8的多核苷酸序列)检测结核杆菌。
3、 由2、所描述的多核苷酸序列经PCR扩增出215/233bp (rpoB)和114bp (IS6110)两个结 核杆菌的片段，分别是具有序列表〈210〉1，序列表〈210〉 2的多核苷酸序列。其特征是与 结核杆菌的原基因序列完全相同。
4、 ropB、 IS6110双分子信标方法的特异性为95-100%，灵敏度1-100个菌/ml。
5、 所建立的微菌落(microcolony， MC)-分子信标检测法的线性范围是103-1011copies/ml， 扩增效率达90%以上。
(二)微菌落-分子信标检测的应用特点
1、 高特异性结核分枝杆菌微菌落培养+ DNA分子信标。
2、 高灵敏度临床标本中结核分枝杆菌浓度《10—20个/ml即可检出。
3、 快速 标本处理后，仅12-72小时内可报告结果。
4、 准确 10-12 h可看到结核杆菌菌落，不仅只检出结核分枝杆菌的活菌，而且由于在同
一个PCR反应中采用多种不同的分子信标探针来检测结核分枝杆菌对利福平的耐药 情况，每种探针用不同的荧光素标记，不同种探针与靶序列完全结合后覆盖了 MTB RNA聚合酶rpoB基因的整个核区域，因此，可同步检测结核分枝杆菌的耐药株。
5、 简单,常规操作，极易掌握。
6、 方便且适用范围广泛1)可检测痰液、胸水、腹水、脑脊液、尿、骨髓等多种标本。 2)用于结核病的实验诊断。3)抗痨玲疗效果的评价。4)尤其是初诊病人的鉴别诊断。 5)用于结核菌耐药性的快速检测。6)用于HIV高危人群的鉴别诊断。7)可检出大 量涂片漏诊患者，可用于HIV高危人群的鉴别诊断。8)对环境无污染。
四、发明目的
针对现有检测结核分枝杆菌技术的不足，本发明的目的在于建立一种微菌落快速培养结 核杆菌以及提供一种用于检测结核分枝杆菌的特有的引物和分子信标及其试剂盒的制备方 法，以便供临床检测和科学研究之用。
本发明为快速培养检测结核杆菌而设计的微菌落培养方法、靶序列RT-PCR引物、DNA 分子信标探针、试剂盒和检测方法及其应用。
51、 本发明还提供了一种用于快速检测生物样品中是否存在结核杆菌以及鉴定结核杆菌死活的 方法。其步骤包括，
(1) 将生物标本接种到贴在罗琴氏培养基上的醋酸纤维素膜上，培养前后均做微菌落实 验，看是否有微菌落形成，以确定细菌的死活。
(2) 采集接种有结核杆菌且培养12-72小时的醋酸纤维素膜，用无菌剪刀剪碎后放入EP 管中，加入200ulDNA提取液
(3) 然后置于沸水中水浴10分钟，制备DNA模板，
(4) 将步骤b)得到的DNA模板进行real time PCR扩增处理
(5) 反应结束后利用软件进行数据分析
由于结核杆菌生长非常缓慢，大约需要12小时才能分裂一代，需要4-8周才能长出可见 菌落，不利于结核病的诊断和流行病学调查。为了达到快速检验的目的，利用显微镜尽可能 早的观察结核杆菌的生长情况不失为一种可行的方法。
用微菌落培养法看到形成微菌落以后，证明接种的细菌是活菌，但不能判断是否是结核 分枝杆菌。为此选择结核杆菌特有的序列ropB,IS6110为靶序列设计引物和探针检测结核杆 菌。
2、 为了实现上述目的针对结核杆菌的特点，首先选择相应的靶序列，然后针对相应的靶序 列设计特异性的'引物，扩增出特异性的目的DNA片段。因此待测基因两端的DNA序列的引 物设计也是本发明的要点。本发明提供了两对检测结核杆菌的引物序列，如下
Tbl f: CAAggAgTTCTTCggCACC
Tbl r: AgCCgATCAgACCgATgTT TB2 f:gCCTACgTggCCTTTgTC TB2 r:ggTCCAgATggCTTgCTC
3、 本发明还提供了检测上述两个靶序列的而设计的两个探针，其序列为
Tbl probe: fam+CAgCgCgTgAgCgTgCCgggCTgCgCTg+dabcyl
Tb2 probe: hex+CAgCgACgCCTACgCTCgCAggATCCTCgCTg+dabcyl
其中环状部分与所述靶序列是完全互补的序列。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等) 和选择性标记基因。
4、 提供分别含有结核杆菌ropB和IS6110的多核苷酸基因工程化的宿主细胞。本发明中， 结核杆菌ropB和IS6110多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞， 以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语"宿主细胞"指原核细胞， 如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表 性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞; 昆虫细胞如果蝇S2或Sfi>;动物细胞如CHO、 COS或Bowes黑素瘤细胞等。
5、 提供生产微菌落-分子信标检测试剂盒的方法。用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA
6序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物 如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的 步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如 显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
6、本发明还涉及本发明的检测试剂盒在结核病的诊断、预防和治疗中的应用，也可用于流行 病学的调查。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
五
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明 范围。
图1是本发明的结核杆菌的微菌落形态。
图2是本发明扩增出的结核杆菌ropB片段凝胶电泳图，233bp。 图3是本发明扩增出的结核杆菌IS6110片段凝胶电泳图，114bp。
六具体实施例方式
(一)实施案例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 sanlbrook等人，分子克隆实验室手册(New York: cold Spring Harbor Laboratory Pres s， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例l:微菌落培养法
1. 按照《临床微生物学手册》的方法配制改良L-J培养基，分装到直径为9cm的培养皿 中。置于烤箱中85'C凝固灭菌30分钟，连续灭菌3天，每天一次。
将MC膜剪成边长2cm的方块，置于紫外灯下双面各照射30分钟，置于无菌容器中备用。
2. 用无菌镊子将紫外线双面照射过(无菌实验阴性)的MC膜贴于制备的培养基表面。 然后载每张膜上滴加庆大霉素和青霉素各10ul，待其吸收后取临床标本10ul加到膜上。
3. 微菌落的观察
① 用无菌镊子将MC膜轻轻取下贴于洁净的载玻片上用电热盘烘干。用无菌镊子将干燥 的MC膜从玻片上取下浸入透明液。
② 将MC膜取出贴于玻片上透明。
7③ 将膜连同玻片一起浸入95%乙醇。
④ 取出后马上用中性树胶固定膜的四周。
⑤ 在油镜下观察细菌微菌落形态，并且拍照记录。
实施例2:提取结核杆菌的DNA-
采集接种有结核杆菌且培养12-72小时的醋酸纤维素膜，用无菌剪刀剪碎后放入EP管中， 加入DNA提取液，然后置于沸水中水浴IO分钟，制备DNA模板，12000rpm离心5分 钟备用。优点在于相当于增菌后提取DNA,增加了检测的灵敏度。
实施例3:标准品的制备
1. 利用基因工程技术，将大小分别为IS6110 (114bp)和RopB (233bp) DNA片断克隆到 PMD-19T载体上，经PCR及测序鉴定，确认构建了标准品重组质粒。
2. 通过梯度稀释质粒浓度，经PCR反应、3%琼脂糖凝胶电泳做灵敏度实验，确认普通PCR 检测结核杆菌下限为103copies/ml。
3. 利用稀释好不同浓度的重组质粒，进行real-time PCR反应，构建阳性标准品，制定标准曲 线，为分子信标荧光定量PCR技术检测结核杆菌奠定了基础。
实施例4:荧光定量PCR(分子信标)进行核算扩增和杂交检测样本的DNA:
根据本发明用于检测生物样品中的结核杆菌是否存在的方法包括以下步骤
a)采集生物样品，进行微菌落试验b)制备DNA模板c)将b步骤得到的DNA模板进行荧光
定量PCR扩增处理，其中所用的引物和探针分别如下
Tbl f: CAAggAgTTCTTCggCACC Tbl r: AgCCgATCAgACCgATgTT
Tbl probe: fam+CAgCgCgTgAgCgTgCCgggCTgCgCTg+dabcyl TB2 f:gCCTACgTggCCTTTgTC TB2 r:ggTCCAgATggCTTgCTC
TB2probe:hex+CAgCgACgCCTACgCTCgCAggATCCTCgCTg+dabcyl
实施例5:微菌落分子信标培养结核菌诊断试剂盒的应用研究 1、微菌落-分子信标联合运用的敏感性的验证
配置一定浓度(例如0.25MCF)结核杆菌菌液，进行不同倍数稀释，然后利用前面建立起来 的标准进行定量，分别定量出1个/10ul、 10个/10ul、 100个/10ul、 1000个/10ul， 10000
8个/10ul， 100000个/10ul等。然后分别取10ul接种于贴在罗氏培养基上的醋酸纤维素膜上， 共3张， 一张用于观察培养前形态， 一张用于观察培养12小时后形态，另外一张用于提取 DNA做荧光定量PCR。
此项实验的目的在于验证微菌落-分子信标方法的敏感性。
2、微菌落-分子信标联合运用的特异性的验证
(1) 购买如下菌株分枝杆菌包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、堪萨斯分枝杆 菌、戈登分枝杆菌、胃分枝杆菌、苏加分枝杆菌、偶然种,母牛分枝杆菌，不产色分校杆菌、蟾蜍分 枝杆菌、次要分枝杆菌、草分枝杆菌、淡黄分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌。非分枝杆菌 包括肺炎杆菌、甲链杆菌、金黄色葡萄球菌、假白喉杆菌、克雷伯杆菌、铜绿假单胞杆菌、表皮葡 萄球菌,大肠埃希菌和卡他球菌等。采用微菌落-分子信标法进行检测。取上述细菌配成一定浊 度的菌液，然后做不同倍数的稀释。
(2) 然后每一种细菌的每一个稀释度取10ul接种到贴在培养基上的醋酸纤维素膜上，共3
张，涂抹均匀。培养12小时，观察生长情况，取一张提取DNA做PCR。
(3) 然后再取上述细菌的混合菌液(包括两种、多种、全部)，取10ul接种到贴在培养基上 的醋酸纤维素膜上，共3张，涂抹均匀。培养12小时，观察生长情况，取一张提取DNA做 PCR。
做此项实验的目的在于验证微菌落-分子信标整个方法的敏感性和特异性。
序列表
〈110〉福建医科大学朱玲 <120>人分枝结核杆菌基因序列 〈140〉 20080410141226 〈141〉 2008-04-10 <■ 10 〈210〉 1 〈211> 233 〈212〉 DNA
〈213〉人分枝结核杆菌rpoB基因序列 〈400〉 1
ca aggagttctt cggcaccagc cagctgagcc 1295 aattcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggttgaccca caagcgccga ctgtcggcgc 1355 tggggcccgg cggtctgtca cgtgagcgtg ccgggctgga ggtccgcgac gtgcacccgt 1415 cgcactacgg ccggatgtgc ccgatcgaaa cccctgaggg gcccaacatc ggtctgatcg 1475 get<210> 2 〈211〉 114 〈212〉 ■
〈213〉人分枝结核杆菌IS6110基因序列 <柳〉2
855 gcctacg tggcctttgt caccgacgcc tacgctcgca ggatcctggg
901 ctggcgggtc gcttccacga tggccacctc catggtcctc gacgcgatcg agcaagccat 961 ctggacc
〈210〉 3 〈211> 27 <212〉腿 〈213〉人工序列 〈400> 3
Tbl f: CAAGGAGTTCTTCGGCACC
<210> 4 〈211> 20 〈212〉 DNA <213>人工序列 〈400> 4
Tbl r: AGCCGATCAGACCGATGTT
〈210> 5 〈211〉 20 〈212〉腿 〈213〉人工序列 〈400〉 5
Tbl probe: fam+CAGCGCGTGAGCGTGCCGGGCTGCGCTG+dabcyl
10〈210〉 6 <211> 21 <212>腿 <213>人工序列 〈400〉 6
TB2 f:GCCTACGTGGCCTTTGTC
<210〉 7 〈211> 22 <212〉讓 〈213〉人工序列 〈400〉 7
TB2 r:GGTCCAGATGGCTTGCTC
<210〉 8 <211〉 22 〈212〉 DNA 〈213>人工序列 〈400〉 8
TB2 probe:hex+CAGCGACGCCTACGCTCGCAGGATCCTCGCTG+dabcyl
权利要求
1.为微菌落分子信标培养结核菌诊断试剂盒及制备方法和应用而设计的、为PCR扩增结核杆菌选定的靶序列而设计的两对引物，所述引物为以下的两对引物Tb1 fCAAggAgTTCTTCggCACC Tb1 rAgCCgATCAgACCgATgTTTB2 fgCCTACgTggCCTTTgTC TB2 rggTCCAgATggCTTgCTC
2. 为检测结核杆菌而设计的两条分子信标，所述的探针为以下的序列，其环状部分与耙序列特异性互补，茎部为与靶序列无关的互补的寡核苷酸。其茎环序列是Tbl probe: fam+CAgCgCgTgAgCgTgCCgggCTgCgCTg+dabcylTb2 probe: hex+CAgCgACgCCTACgCTCgCAggATCCTCgCTg+dabcyl
3. 根据权利要求2所述的分子信标，其特征在于，5端分别标记FAM和HEX的荧光素，而3 端标记DABCYL淬灭剂。
4. 一种用于检测结核杆菌的方法，包括以下步骤a) 采集接种有结核杆菌且培养12-72小时的醋酸纤维素膜，用无菌剪刀剪碎后放入EP 管中，加入200ulDNA提取液，b) 然后置于沸水中水浴10分钟，制备DNA模板，c) 将步骤b)得到的DNA模板进行real time PCR扩增处理，d) 反应结束后利用软件进行数据分析。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述生物样品选自结核病人或者疑似结核病人的 痰液、胸腹水、血液、尿液、脑脊液等。且其步骤d)是采用分子信标荧光检测。
6. 根据权利要求2所述的各分子信标的实验优化条件包括镁离子工作浓度为2. 5mM-3. 5mM, 退火温度为52-6(TC,上游、下游引物浓度均选择为0. 2-0. 4mM。
7. 根据权利要求2， 6所述的ropB、 IS6110双分子信标方法的特异性为95-100%，灵敏度1-100 个菌/ml。
8. 根据权利要求2,4,7所述而建立的微菌落(microcolony，MC)-分子信标检测法的线性范围 是103-10"copies/ml，扩增效率达90%以上。特异性为》95°/0。
9. 一种用于检测结核杆菌的试剂盒，包括根据权利要求1,2,3所述的两对引物和两条分子信 标探针，罗琴氏培养基，选择性培养基的制备，醋酸纤维素膜，阳性对照液和阴性对照液， 所用DNA提取液为50腿ol/LNaOH、 10mmol/LTris.HCl(pH8.0)、 1% Triton、X-100、 l%NP-40、 0.5mmol/LEDTA(pH8.0)，载玻片，95%乙醇，酒精苯酚(无水乙醇苯酚=1: 10)，核酸扩增和杂交反应管内装0.02-0.04ml的核酸扩增混合液，两对序列分别为 Tbl f: CAAggAgTTCTTCggCACC Tbl r: AgCCgATCAgACCgATgTTTbl probe: fam+CAgCgCgTgAgCgTgCCgggCTgCgCTg+dabcyl TB2 f:gCCTACgTggCCTTTgTC TB2 r:ggTCCAgATggCTTgCTC TB2probe:hex+CAgCgACgCCTACgCTCgCAggATCCTCgCTg+dabcyl
10. —种用于检测结核杆菌及其耐药菌的试剂盒，其中选择性培养基的制备特征在于在罗琴氏培养基上加入对革兰氏阳性球菌有效的抗生素(400ug/ml)和对革兰氏阴性杆菌有效 的抗生素(400ng/ml)各50yl。
全文摘要
本发明公开了微菌落-分子信标检测法，一种用于结核杆菌快速培养的诊断试剂盒。同时阐明了该诊断试剂盒的制备方法；并就其临床应用做了科学的表述。尤为重要的是指明了该诊断试剂盒的临床应用价值和巨大的开发前景。
文档编号C12N15/11GK101560542SQ20081007088
公开日2009年10月21日 申请日期2008年4月14日 优先权日2008年4月14日 公开号200810070887.发明者玲 朱 申请人:福建医科大学