中的试剂包括特异性与扩增产物结合的探针。
[0045] 在另一优选例中，所述试剂盒还含有用于检测扩增产物的试剂，所述的试剂包括 探针、和/或核酸芯片。
[0046] 在本发明的第H方面，提供了一种氧化石墨帰的用途，该用途用于制备或用作提 高多重聚合酶链式反应的灵敏度和特异性的增强剂。
[0047] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[004引图1显示了不同浓度的氧化石墨帰对多重PCR特异性的影响。其中，W人类基因组 为模板扩增8个癌症基因，M表示DNA marker, N表示不加模板、不加氧化石墨帰的阴性对 照，C表示不加氧化石墨帰、加入模板的阳性对照。泳道1-9分别表示加入氧化石墨帰30、 60、90、120、150、180、210、240 和 270ng的多重PCR结果。图中从下向上产物长度依次为： 52bp、74bp、90bp、131bp、152bp、176bp、336bp 和 552bp。
[0049] 图2显示了氧化石墨帰对多重PCR灵敏度的影响。其中，W人类基因组为模板同 时对8个癌症基因进行多重扩增；M表示DNA marker,Nl表示不加模板、不加氧化石墨帰的 阴性对照；A组表示不加氧化石墨帰的多重扩增结果，其中A1-A4分别表示加入模板175ng、 25ng、5ng和Ing的扩增结果；N2表示加入氧化石墨帰、不加模板的阴性对照；B组表示加人 250ng的多重扩增结果，其中B1-B4分别表示加入模板175ng、25ng、5ng和Ing的扩增结果。 图中从下向上产物长度依次为；5化口、746口、9化口、13化口、15化口、17化口、3366口和55化口。
[0050] 图3分别显示了不加和加入了适量氧化石墨帰后，在不同退火温度下的多重PCR 结果。其中M表示DNA marker值L 2000)，A组表示不加氧化石墨帰的多重扩增结果，B组 表示加氧化石墨帰巧化g)的多重扩增结果。Nl表示不加模板、不加氧化石墨帰的阴性 对照；其中A1-A6表示不加入GO情况下在不同退火温度下的多重扩增结果；N2表示加入 GO巧化g)但不加模板的阴性对照；B1-B6组表示加入50ng氧化石墨帰时在不同退火温度 下的多重扩增结果。图中从下向上产物长度依次为；l(Hbp、202bp、323bp、524bp、630bp、 754bp、1045bp 和 1674bp。
[0051] 图4显示了氧化石墨帰对多重PCR均一性的提高效果。其中，W人类基因组DM为 模板DNA。其中，M表示DNA marker, A组表示不加氧化石墨帰的多重扩增结果，B组表示加 氧化石墨帰巧化g)的多重扩增结果。Nl表示不加模板、不加氧化石墨帰的阴性对照；其中 A1、A2表示不加入GO的3重扩增结果；N2表示加入GO巧化g)但不加模板的阴性对照；B1、 B2组表示加入50ng氧化石墨帰的3重扩增结果。图中从下向上产物长度依次为；176bp、 203bp 和 258bp。
[0052] 图5显示了不同浓度的氧化石墨帰对Lambda DNA多重扩增的影响；对多重PCR后 的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。M表示DNA marker,N表示不加模 板、不加氧化石墨帰的阴性对照，C表示不加氧化石墨帰、加入模板的阳性对照。泳道1-9分 别表示加入氧化石墨帰50、100、150、200、250、300、350、400和450叫的多重？0?结果。图 中从下向上产物长度依次为；10化口、1626口、2026口、3236口、5246口、6306口、7546口和 10456口。
[0053] 图6显示了不同浓度的氧化石墨帰对含有错配的引物的扩增优化。图6A为不含 错配的引物的扩增结果，图6B为正向引物中含有一个错配碱基（红色G)的扩增结果。M表 示DNA marker, Nl和N2表示不加模板、不加氧化石墨帰的阴性对照。每组1-4分别表示加 入 0、50、100、150ng 氧化石墨帰（GO)。
[0054] 图7显示了短引物（15个碱基）的单重PCR结果W及不同浓度的氧化石墨帰对 短引物单重PCR的扩增优化效果。其中，A、B、C组分别表示使用15个碱基的引物对基因 TS皿、PDGFRA和EGFR的扩增结果。扩增产物长度分别为；mbp、132bp和15化P。其中图 八1、81、(：1表示无氧化石墨帰优化的？0?在不同退火温度（30、35、40、45、50、55°〇的扩增 结果。图A2、B2、C2分别表示在不同氧化石墨帰浓度下PCR的扩增结果，图下方的数字表示 每个PCR反应对应的氧化石墨帰用量。
[00巧]图8显示了切胶回收产物的二次扩增电泳检测结果。图8A-图細分别表示产物 为552、336、176、152、131、90、74、52bp(分别编为样品1至样品8)的二次扩增电泳结果。 每组中N表示不加 DNA模板的阴性对照；P1-P8表示各组的阳性对照，模板为人类基因组 (25ng) ;A-H组中1、2泳道（如A1、A2)分别表示各组二次扩增的结果。表1显示了各产物 对应基因名称、待扩增基因所在的染色体编号和扩增产物的理论长度；实际测序的一致区 域和测序产物长度。
【具体实施方式】
[0056] 本发明人通过广泛而深入的研究，通过对试验条件的大量筛选，首次开发了一种 优化的多重聚合酶链式反应方法。通过本发明方法，可在含低拷贝量复杂模板（如1或5ng 人类基因组模板）的、极其产生非特异性扩增的多重PCR反应体系（如8个或更多个引物 对）中，非常高效而准确地扩增出全部特异性扩增产物。在此基础上完成了本发明。
[0057] 术语
[0058] 在本发明中，术语"多重聚合酶链式反应（多重PCR)"指在一个PCR反应中，使用 多对特异性引物对多个基因进行同时扩增。在本发明中，所述的多重通常指3-20重，较佳 地3-15重，更佳地5-10重。
[0059] 氧化石墨帰
[0060] 在本发明中，所述的多重PCR反应体系中含有一定量的氧化石墨帰。
[0061] 在本发明中，适用的氧化石墨帰没有特别限制，可W采用市售的或用常规方法制 备的氧化石墨帰。通常，可将石墨用强酸氧化而制得氧化石墨帰。
[0062] 通常，氧化石墨帰的表面具有駿基、居基、和/或氨基等基团。此外，氧化石墨帰还 可含有其他任选的官能团，例如撰基等。可用于本发明的氧化石墨帰没有特别限制，通常包 括（但并不限于）；利用改进的Hummer法制备的水溶性氧化石墨帰。一类优选的氧化石墨 帰是表面含有駿基或居基基团的氧化石墨帰。
[0063] 本发明的试验表明，对于低模板量的高复杂度的多重PCR反应体系，氧化石墨帰 可显著提高PCR的特异性、灵敏度和扩增产量，并可消除扩增中形成的引物二聚体。
[0064] 在本发明的多重PCR反应体系中，氧化石墨帰的用量通常为为100 - 5(K)ng/25微 升；较佳地150 - 40化g/25微升；较佳地200 - 30化g/25微升。
[00财 多重引物对
[0066] 在本发明中，所使用的多重引物对包括3个或更多个引物对。
[0067] 在本发明中，用于扩增的多重引物对可包括3-50个引物对或3-30个引物对。通 常，本发明多重PCR反应体系中含有3-15个引物对，较佳地5-10对，更佳地6-9个引物对。
[0068] 在另一优选例中，所述的用于扩增的引物对中至少一个或多个或全部引物（优选 全部引物）的长度为15-2化P，较佳地15-20bp，更佳地为15-18bp，最佳地为15-1化口。
[0069] 在另一优选例中，所述的用于扩增的引物对包括多个引物对，且所有引物中各引 物的Tm的最大值Tmax与各引物的Tm的最小值Tmin之间差值A =〇-5°C，较佳地A = 0-rc。
[0070] 在另一优选例中，所述的引物对中，至少有2个引物对共用同一引物（作为通用的 上游引物或下游引物），并且所述至少2个引物对的另一侧引物仅相差1 - 2个碱基。
[0071] 在另一优选例中，所述引物对中只含有一个错配碱基。如本文所用，所述"引物对 中只含有一个错配碱基"指第一引物对与第二引物对的序列除了一个引物相差1个碱基之 夕F，完全相同。较佳地，所述的错配碱基位于3'端或位于引物的中间区域。
[007引多重PCR反应体系
[0073] 在本发明中，多重PCR反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶、 氧化石墨帰和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂。
[0074] 通常，所述的待扩增的模板是来源于各种不同生物体（包括病原体、细菌、哺乳动 物如人）的总核酸提取物，例如基因组模板。
[00巧]典型地，在多重PCR反应体系中，模板的浓度通常为0. 1-1化g/微升，较佳地为 0. 5-5ng/微升，更佳地为0. 8-化g/微升（如约Ing/微升）。
[0076] 在本发明的多重PCR反应体系中，所述引物对中各引物浓度没有特别限制。典 型地，各引物的终浓度为0. 05-0. 5 U M，较佳地为0. 1-0. 4 U M，更佳地为0. 1-0. 3 U M(约 0. 2 U M)。
[0077] 应理解，在本发明多重PCR反应体系中，可含有其他有助于进行聚合酶链式反应 其他试剂或成分，例如包括（但并不限于）一种或多种选自下组的试剂：
[0078] (i) PCR缓冲液（含镇离子等）
[0079] (ii)dNTP
[0080] (iii)ddH2〇〇
[0081] 在本发明中，所述聚合酶链式反应体系的总体积没有特别限制，通常可W为 10-200微升，较佳地20-100微升，更佳地25-50微升。
[0082] 扩增方法及扩增产物
[0083] 采用本发明的多重PCR反应体系，可在常规的PCR反应条件下进行扩增。
[0084] 典型地，该扩增方法包括变性、退火和延伸步骤，并且包括20-50个循环。
[0085] 在另一优选例中，聚合酶链式反应的退火温度为Tfg ±5°C，较佳地为Tf ±3°C， 其中为所有引物的Tm的算术平均值。
[0086] 在另一优选例中，聚合酶链式反应的退火温度为45-7(TC，较佳地为约50°C。
[0087] 在本发明中，由于采用了特别优化的反应条件，因此，即使采用高达8个或更多个 引物对，仍可高效准确地扩增出全部所需的扩增产物，且可有效抑制了引物二聚体和其它 非特异性产物的形成。
[0088] 在本发明中，所述扩增产物包括分别对应于所述引物对的n种扩增产物。通常， 在本发明的反应混合物中，所述n扩增产物中扩增量最大的扩增产物A与所