一种观察不同生理状态pc12细胞之间相互影响的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学领域，更具体地，本发明涉及一种观察不同生理状态PCl 2细胞之间相互影响的方法。
【背景技术】
[0002]细胞生长的微环境是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件。细胞对外界的微环境非常敏感，在同一共培养体系中，细胞之间或细胞与胞外基质之间的直接接触可以影响细胞的生长状态。近几十年来，在放射生物学领域发现，当少数细胞受到射线照射时，没有受到射线直接照射的周围细胞也能表现出一些损伤效应。
[0003]大量研究已经证明在体内和体外实验中确实存在损伤传递效应。例如，慢性粒细胞白血病患儿的脾部在接受放射线照射治疗时，胸骨骨髓细胞发生了损伤；局部氧化损伤可以通过GJIC在内皮细胞之间传递。有人提出用肿瘤自杀基因治疗肿瘤，当部分肿瘤细胞转染自杀基因后，在药物启动转染细胞自杀后，转染细胞及周围未转染细胞均被杀灭。近年来，有人发现局部氧化损伤可以通过细胞间缝隙连接通讯(GJIC)在上皮细胞间传递。以上所述存在着一个共同的现象，就是某些有害因素引起的靶细胞损伤不仅仅局限于靶细胞本身，还可以引起周围正常细胞产生损伤。暴露于有害因素的细胞群会出现明显的生物效应，这种效应在暴露细胞群和周围未暴露细胞群都会发生，这一现象人们称之为旁观者效应(bystander effect，BE)。
[0004]旁观者效应是指正常细胞在直接受到有害因素损害的靶细胞诱导下发生的诸如细胞死亡、基因突变、染色体不稳定等反应，这些经诱发而发生效应的正常细胞成为旁观者细胞。由于旁观者效应的存在，使靶细胞的损伤效应得以延续与放大，从而使损伤明显加重。这些研究提醒人们:机体对损伤的反应不仅仅是单个独立细胞或者组织，而是具有群体性。对于旁观者效应的发现已有几十年，但至今为止，旁观者效应的确切机制尚未阐明。越来越多研究表明，旁观者效应可能与缝隙连接蛋白(connexin，Cx)介导的细胞间隙连接通讯(gap-junct1nal intercellular communicat1n，GJIC)有密切关系。
[0005]目前国外内研究中，普遍采用对培养细胞整体染毒，采用cBX抑制缝隙连接，在损伤细胞的情况下，检测诱导细胞的凋亡情况，探寻在损伤过程中的信号传递机制，但此种方法未能有效区分染毒与未染毒细胞。还有人通过辐射照射培养皿中的部分细胞，观察未被照射细胞的凋亡情况，但这种研究方法只限于辐射暴露，未能应用到溶于培养液中的化学物质对细胞的影响。如何有效区分共培养细胞中染毒和未染毒细胞是急需解决的技术难题。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种观察不同生理状态PC12细胞之间相互影响的方法，该方法可以区分不同生理状态细胞在同一培养环境下，染毒与未染毒PC12细胞的生理状态。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案:
[0008]一种观察不同生理状态PC12细胞之间相互影响的方法，包括以下步骤:
[0009](I)、构建GFP稳定转染PCl2细胞株
[0010]将处于对数生长期的PC12细胞弃去原培养液，用PBS洗涤后加入适量Trypsin-EDTA，消化后接种至六孔板，待细胞完全贴壁后进行转导，转导前，每孔细胞换成新鲜的HD+10%FBS培养基或1640+20%FBS培养基，每株各选取一孔细胞加入30yL的Lent1-eGFP/Neo，充分摇匀后培养箱中培养转导7小时后，吸去含有Lent1-eGFP/Neo的培养基，换成新鲜的HD+ 10%FBS培养基或1640+20%FBS培养基，再放入培养箱中培养转导48小时，构建得到GFP-PC12；
[0011](2)、共培养体系建立
[0012]设置两个共培养体系:一是在GFP-PC12中加入毒性因子培养后，将PC12与经MPb处理的GFP-PC12按等比例混合共培养;二是将PC12与GFP-PC12按等比例混合共培养，两个培养体系均于37 °C共培养20分钟后，用PBS冲洗细胞2?3次；
[0013](3)、共培养体系的ROS水平、凋亡水平、线粒体跨膜电位检测
[0014]分别在两个共培养体系中加入H0eChst33342染料进行核复染，激光共聚焦分析细胞中ROS水平；
[0015]分别在两个共培养体系中加入TMRM进行线粒体跨膜电位检测；
[0016]分别在两个共培养体系中加入AnnexinV-PE或7-AAD进行细胞凋亡水平检测。
[0017]在其中一些实施例中，步骤(I)中，所述PC12细胞消化后按lX105cells/9.6cm2的密度接种至六孔板上。
[0018]在其中一些实施例中，步骤(I)中所述培养箱的培养条件为:37°C、5%CO2、95%相对湿度。
[0019]在其中一些实施例中，步骤(2)中共培养使用的培养基为HD+10%FBS培养基或1640+20% FBS 培养基。
[0020]在其中一些实施例中，步骤(3)中细胞中的ROS水平是使用带有350nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜进行分析的。
[0021]在其中一些实施例中，步骤(3)中AnnexinV-PE进行细胞凋亡水平检测时，流式细胞仪的激发波长Ex = 488nm，发射波长Em = 578nm，使用FL2通道检测。
[0022]在其中一些实施例中，步骤(3)中7-AAD进行细胞凋亡水平检测时，流式细胞仪的激发波长Ex = 546nm，发射波长Em = 647nm，使用FL3通道检测。
[0023]在其中一些实施例中，步骤(3)中所述Hoechst33342染料的浓度为50μΜ。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0025]本发明的观察不同生理状态PC12细胞之间相互影响的方法将醋酸铅染毒细胞与未染毒细胞直接接触混合共培养后，加入不同的染料，由于染毒细胞基底颜色为绿色荧光，可与不同颜色荧光叠加，这样就可区分出染毒细胞，从而可以观察染毒细胞对周边未染毒正常细胞正常生理状态是否造成了影响，有效区分同一培养环境下的细胞的不同生理状态，解决了之前不能有效区分同一培养环境下同种细胞不同染毒状态的问题。
【具体实施方式】
[0026]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027]以下实施例中的原料如无特殊说明，均来源于市售。
[0028]实施例1 一种观察不同生理状态PC12细胞之间相互影响的方法
[0029]包括以下具体步骤:
[0030](一)PC12 细胞复苏
[0031]从液氮罐中取出PC12细胞冻存管，迅速投入37°C水浴中，并摇动令其尽快融化，冻存管酒精消毒后用巴士吸管吸出细胞悬浮液，注入离心管并加入10倍的含有5%胎牛血清和5 %马血清的DMEM培养液，混合后离心(100rpm，5min)，除去上清液，用培养液(含有5 %胎牛血清和5%马血清的DMEM培养液)稀释成I X 14个/ml密度的细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中，每瓶1ml，置于37°C、含5%C02的培养箱内进行培养。
[0032](二)PC12 细胞培养
[0033]PCl 2细胞经过复苏培养，细胞单层长满后，弃培养基，每瓶加Iml 0.25%胰酶_EDTA进行消化，部分细胞脱落后加入含10 %胎牛血清的完全培养液终止消化，将细胞轻轻吹打分散至单细胞悬液后，移入1ml离心管中，混合后离心(1000rpm，5min)，弃上清液，用ImL含10%血清的完全培养液重悬，平均分成三份，接种于三个25cm2培养瓶中，置于培养箱中按上述步骤(一)方法培养，每2-3天传代一次。实验所用的细胞均处于对数生长期。
[0034](三)稳转细胞株构建
[0035]1、PC12细胞转染前准备
[0036](1)将邢+10%?83培养基、1640+20%?83培养基、1\?83和1^7?8丨114014预先平衡至到室温；
[0037](2)将传代培养后的细胞上清收集送检无菌，待无菌检测结果确定后，通过传代培养(使用HD+10 % FBS培养基或1640+20 % FBS培养基)进行细胞状态的调整，细胞在培养瓶中长满后，吸去培养基，用I X PBS洗涤细胞2-3次，以去除残留的血清；
[0038](3)吸去PBS，加入适量Tryps in-EDTA，轻轻旋转，使Tryps in-EDTA均匀覆盖培养器皿表面，消化1-2分钟使细胞脱壁，显微镜下可见细胞间隙增大，细胞变圆，用手轻拍培养器皿的壁，立即加入2mL的HD+10%FBS培养基或1640+20%FBS培养基终止消化；
[0039](4)用吸管吸取液体，轻轻吹打培养器皿表面，反复3-5次，使细胞彻底脱离瓶皿底壁，将细胞移入离心管中，再向培养瓶中加入I XPBS洗1-2次，并将洗液一并转移至离心管中；
[0040](5)244g离心4分钟，吸去上清液；
[0041 ] (6)加入5mL的HD+10%FBS培养基或1640+20%FBS培养基重悬细胞沉淀，用吸管轻轻吹打收集的细胞悬液，取样计数；
[0042](7)参照计数结果，取lX105cellS/9.6cm2的密度接种至六孔板，各接种2个孔。
[0043]2、GFP 转导 PC12 细胞
[0044](