Tnfr1/map4k4/arp3三聚体复合物在胶质瘤侵袭性生长中的应用
【专利摘要】本发明所要解决的技术问题是提供调节TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物含量在抑制胶质瘤侵袭性生长中的应用以及提供调节TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物含量在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用。有利于寻找新的治疗靶点，进行有目的的肿瘤干预治疗和药物开发，改善胶质瘤患者的预后。
【专利说明】TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在胶质瘤侵袭性生长中的应用
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及脑胶质瘤瘤侵袭性生长的研究领域，具体涉及调节TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物含量在抑制胶质瘤侵袭性生长中的应用，以及调节TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物含量在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用。
[0003]
【背景技术】
[0004]胶质瘤(Gl1ma)是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，占全部颅内肿瘤发病率的46%。随着医学发展，胶质瘤的诊疗技术有了很大的提高和改进，但病人治疗后短期内复发率很高，总体预后仍不理想，究其原因与胶质瘤侵袭性生长的生物学特性有关，即胶质瘤细胞能侵入周围正常的脑组织，造成外科手术难以将肿瘤完全切除，而后续的放疗及化疗难以彻底消灭已侵入到周围正常脑组织中的胶质瘤细胞，从而导致胶质瘤术后复发。长期以来对于胶质瘤侵袭性生长的研究主要着重于胶质瘤细胞内相关癌基因的作用机制，而忽略了炎症微环境的作用。1863年，现代病理学奠基人Rudolf Virchow就提出假说:炎症微环境是导致包括肿瘤在内的多种慢性疾病的原因之一。最近越来越多的实验和临床研究已经证实了这一假说，而这也是当前肿瘤研究的热点。组织损伤，无论是物理，化学或感染所致，均会发生炎症反应，是机体对伤害刺激的防御反应的一部分，但机体免疫功能未能控制的炎症反应将会扰乱细胞的微环境，从而导致癌症相关基因和细胞信号蛋白的翻译后修饰的改变；同时巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞等炎症细胞可导致包括肿瘤坏死因子a(tumornecrosis factor-α，TNF-α )、白介素-6 ( inter I eukin- 6，IL-6)、转化生长因子-β(transforming growth factor-0，TGF_0)等在内的非特异性炎性细胞因子上调，从而支持肿瘤的发生发展。在恶性胶质瘤中，肿瘤相关巨噬细胞的浸润往往提示肿瘤患者预后的不良，说明炎症微环境在胶质瘤的发生发展中起关键作用。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供:
TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在胶质瘤侵袭性生长中的应用。
[0007]进一步的，所述TNFRl因子在胶质瘤侵袭性生长中的应用。
[0008]进一步的，所述MAP4K4因子在胶质瘤侵袭性生长中的应用。
[0009]进一步的，所述ARP3因子在胶质瘤侵袭性生长中的应用。
[0010]进一步的，TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用。
[0011]进一步的，所述TNFRl因子在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用。
[0012]进一步的，所述MAP4K4因子在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用。
[0013]进一步的，所述ARP3因子在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用。
[0014]有利于寻找新的治疗靶点，进行有目的的肿瘤干预治疗和药物开发，改善胶质瘤患者的预后。
[0015]研究方法:
I，研究不同胶质瘤瘤体中心组织及周边组织中ARP3及MAP4K4蛋白表达情况，分析两者的相关性及其与临床病理因素的关联性;利用ARP3与MAP4K4的表达载体及小干扰质粒，确定两者之间的相互作用以及作用的结构域;检测ARP3与MAP4K4相互作用对ARP3磷酸化的调节，明确两者相互作用机制；明确ARP3与MAP4K4相互作用对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生存、迀移及侵袭能力的调节作用；将干预ARP3及MAP4K4表达的胶质瘤细胞株注射至裸鼠脑皮质内，构建裸鼠脑内胶质瘤形成模型，探索干预ARP3与MAP4K4相互作用对胶质瘤动物模型中肿瘤发生及侵袭的影响；利用TNFRl、ARP3及MAP4K4的表达载体及小干扰质粒，确定三者之间的相互作用以及作用的结构域。
[0016]2，研究不同胶质瘤瘤体中心组织及周边组织中ARP3及MAP4K4蛋白表达情况，分析两者的相关性及其与临床病理因素的关联性;利用ARP3与MAP4K4的表达载体及小干扰质粒，确定两者之间的相互作用以及作用的结构域;检测ARP3与MAP4K4相互作用对ARP3磷酸化的调节，明确两者相互作用机制；明确ARP3与MAP4K4相互作用对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生存、迀移及侵袭能力的调节作用;将干预ARP3及MAP4K4表达的胶质瘤细胞株注射至裸鼠脑皮质内，构建裸鼠脑内胶质瘤形成模型，探索干预ARP3与MAP4K4相互作用对胶质瘤动物模型中肿瘤发生及侵袭的影响；利用TNFRl、ARP3及MAP4K4的表达载体及小干扰质粒，确定三者之间的相互作用以及作用的结构域
3，检测TNFRl、ARP3与MAP4K4相互作用对MAP4K4、ARP3磷酸化的调节，明确TNFRl、ARP3与MAP4K4三者相互作用机制；明确TNFR1、ARP3与MAP4K4相互作用对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生存、迀移及侵袭能力的调节作用；研究不同胶质瘤瘤体中心组织及周边组织中TNFRl、ARP3及MAP4K4蛋白表达情况，分析三者表达的相关性及其与临床病理因素的关联性;将干预TNFRl、ARP3及MAP4K4表达的胶质瘤细胞株注射至裸鼠脑皮质内，构建裸鼠脑内胶质瘤形成模型，探索干预TNFRl、ARP3与MAP4K4相互作用对胶质瘤动物模型中肿瘤发生及侵袭的影响。
[0017]研究结果表明，TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用可以促进胶质瘤细胞侵袭性生长，其机制为TNF-α活化TNFRl后，招募并激活MAP4K4，磷酸化ARP3，激活ARP2/3复合物，促进肌动蛋白聚合及伪足形成。因此，调节TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物含量在抑制胶质瘤侵袭性生长中的应用以及调节TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物含量在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用有了理论依据。
[0018]本发明以炎症微环境中炎症因子对胶质瘤侵袭性生长的作用为研究对象，以TNFRl与ARP3相互作用作为切入点，研究TNFRUARP3及MAP4K4相互作用对胶质瘤侵袭性生长的调节作用及其机制。为胶质瘤的分子治疗提供新的药物开发靶点。
[0019]
【附图说明】
[0020]图1是胶质瘤组织中TNFRl、ARP3的表达情况(A.免疫组化检测不同级别胶质瘤病理组织中TNFRl和ARP3的表达；B.WesternBlot检测不同级别胶质瘤病理组织中TNFRl和ARP3的表达。)
图2是130例胶质瘤组织标本中TNFRl及ARP3的表达与临床病理因素的相关性。(注:*P〈0.05，差异有统计学意义。)
图3是胶质瘤组织中TNFRl与ARP3表达的相关性(统计学分析显示胶质瘤中TNFRl与ARP3的表达呈正相关。)
图4是细胞划痕及Transwell实验证实TNFRl促进胶质瘤细胞迀移及侵袭。(A.胶质瘤U251细胞中转染TNFRl过表达及空载质粒，36小时后行细胞划痕实验检测细胞迀移能力;B.胶质瘤U251细胞中转染TNFRl过表达及空载质粒，36小时后行Transwel I实验检测细胞侵袭能力。)
图5是胶质瘤组织中TNFRUMAP4K4及ARP3存在相互作用(A.免疫共沉淀检测胶质瘤组织中TNFRl与ARP3的相互作用；B.免疫共沉淀检测胶质瘤组织中TNFRl与MAP4K4的相互作用;C.免疫共沉淀检测胶质瘤组织中MAP4K4与ARP3的相互作用。)
图6是胶质瘤细胞中TNF-α对胶质瘤细胞迀移、侵袭能力及ARP3磷酸化的影响，ARP3磷酸化与胶质瘤细胞迀移、侵袭能力的关系。(A.在胶质瘤U251细胞中予以Ong/ml，lng/ml，10ng/ml，50ng/ml及 100ng/ml的TNF-a刺激24小时，收集细胞蛋白，WesternBlot检测p_ARP3的表达情况；B.在胶质瘤U251细胞中予以TNF-α 50ng/ml刺激24小时，细胞划痕实验检测细胞迀移能力；C.在胶质瘤U251细胞中予以TNF-α 50ng/ml刺激24小时，Transwell实验检测细胞侵袭能力;D.在胶质瘤U251细胞中予以TNF-α刺激，收集细胞蛋白，western blot检测卩-八!^33』-0&(11161'；[11、￥；[1116111:；[11及1^-0&(11161'；[11的表达。)
图7是研究方法步骤I的技术路线图。
[0021 ]图8是研究方法步骤2的技术路线图。
[0022]图9是研究方法步骤3的技术路线图。
[0023]图10是研究方法步骤4的技术路线图。
[0024]
【具体实施方式】
[0025]研究内容:
I，分析TNFRl与MAP4K4的相互作用及其机制，明确胶质瘤炎症微环境中，TNFRl招募并激活MAP4K4，从而促进胶质瘤侵袭性生长。
[0026](I)验证胶质瘤及正常脑组织中TNFRl与MAP4K4的表达，分析两者表达的相关性，及与临床病理因素包括患者病理级别、复发及预后的相关性。
[0027](2)分别在胶质瘤组织、工具细胞及胶质瘤细胞中验证并分析TNFRl与MAP4K4的相互作用，并根据各自结构域特点分别构建截短突变质粒，明确其相互作用结构域。
[0028](3)在TNF-a刺激下，干预TNFRl表达或TNFRl与MAP4K4相互作用，分别在胶质瘤细胞株及工具细胞中明确TNFRl与MAP4K4相互作用对MAP4K4磷酸化修饰的调节作用。
[0029](4)在TNF-α刺激下，干预TNFRl表达或TNFRl与MAP4K4相互作用，分析TNFRl与MAP4K4相互作用对胶质瘤细胞迀移及侵袭能力的影响。
[0030](5)分别构建TNFRl过表达、小干扰及不与MAP4K4相互作用的突变细胞株，利用裸鼠构建胶质瘤脑内模型，明确TNFRl与MAP4K4的相互作用对动物模型中胶质瘤发生发展的影响。
[0031]2，分析MAP4K4与ARP3的相互作用及其机制，明确在胶质瘤进展中，MAP4K4通过磷酸化ARP3，激活ARP2/3复合物，促进肌动蛋白聚合及伪足形成，增强胶质瘤细胞的侵袭性。
[0032](I)验证胶质瘤及正常脑组织中MAP4K4与ARP3的表达，分析两者表达的相关性，及与临床病理因素包括患者病理级别、复发及预后的相关性。
[0033](2)分别在胶质瘤组织、工具细胞及胶质瘤细胞中验证并分析MAP4K4与ARP3相互作用，并根据各自结构域特点分别构建截短突变质粒，明确其相互作用结构域。
[0034](3)干预MAP4K4表达或MAP4K4与ARP3相互作用，分别在胶质瘤细胞株及工具细胞中明确MAP4K4与ARP3相互作用对ARP3磷酸化修饰的调节作用。
[0035](4)干预MAP4K4表达或MAP4K4与ARP3相互作用，分析MAP4K4与ARP3相互作用对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迀移、侵袭能力的调节作用。
[0036](5)分别构建MAP4K4过表达、小干扰及不与ARP3相互作用的突变细胞株，利用裸鼠构建胶质瘤脑内模型，明确MAP4K4与ARP3的相互作用对动物模型中胶质瘤发生发展的影响。
[0037]3，分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体的相互作用及其机制，明确胶质瘤炎症微环境中，TNFRl通过招募并激活MAP4K4，从而磷酸化ARP3，激活ARP2/3复合物，促进肌动蛋白聚合及伪足形成，增强胶质瘤细胞的侵袭性。
[0038](I)分别在胶质瘤组织、细胞及工具细胞中分析及验证TNFR1、MAP4K4、ARP3三者的相互作用，并利用上述研究内容的结果，分别干预TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3复合物形成，明确TNFRl与ARP3的相互作用与MAP4K4的相关性。
[0039](2)分别在胶质瘤细胞及工具细胞中干预TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3复合物形成，明确TNFRl影响MAP4K4对APR3的磷酸化作用。
[0040](3)分别在胶质瘤细胞及工具细胞中干预TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3复合物形成，明确TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、细胞伪足形成及细胞迀移、侵袭能力的影响。
[0041]4，利用胶质瘤临床病理标本及构建裸鼠胶质瘤脑内模型，在整体水平全面探讨分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体对胶质瘤在体内侵袭性生长的影响。
[0042](I)综合分析胶质瘤及正常脑组织中TNFRl、MAP4K4与ARP3表达的相关性及与临床相关因素包括患者病理级别、复发及预后的相关性。
[0043](2)分别构建TNFRUMAP4K4与ARP3过表达、小干扰的稳定细胞株，以I X 108密度在脑立体定位仪下注射至裸鼠皮质内，构建裸鼠胶质瘤脑内模型。
[0044](3)4周后收集脑组织，检测肿瘤形成的大小、重量等情况，并比较其与裸鼠生存率的关系，HE染色检测肿瘤侵袭情况。
[0045](4)获取裸鼠肿瘤组织Western Blot及免疫组化检测TNFRl、MAP4K4与ARP3 的表达情况。
[0046](5)组织消化，原代细胞培养，重复研究内容2.1.3，分析并验证TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体对裸鼠原代胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、细胞伪足形成及细胞迀移、侵袭能力的影响。
[0047]研究方案:
步骤I，分析TNFRl与MAP4K4的相互作用及其机制，明确胶质瘤炎症微环境中，TNFRl招募并激活MAP4K4，从而促进胶质瘤侵袭性生长。
[0048]本部分实验步骤如图7:
(I)验证胶质瘤及正常脑组织中TNFRl与MAP4K4的表达，分析两者表达的相关性，及与临床病理因素包括患者病理级别、复发及预后的相关性。
[0049]I)收集130例胶质瘤病例的病理组织石蜡标本，病例选择标准为:①有影像学明确诊断(包括CT及核磁共振);②有术后病理明确诊断;③术前无放疗、化疗及激素治疗;④组织分型和病理分级参照《2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准》。收集40组胶质瘤术后新鲜癌组织及癌旁组织，结合临床作出明确的组织分型和病理分级诊断。另取10例因急性脑外伤行内减压术所得正常脑组织标本为对照。
[0050]2)通过Western Blot和免疫组化等方法，研究不同病理分级的胶质瘤组织、胶质瘤瘤体中心组织及周边组织中TNFRl与MAP4K4的蛋白表达情况，将蛋白表达情况与胶质瘤的临床因素进行相关性统计，分析TNFRl与MAP4K4表达的相关性及其表达与胶质瘤患者病理级别、复发及预后的相关性。
[0051 ] (2)分别在胶质瘤组织、工具细胞及胶质瘤细胞中验证并分析TNFRl与MAP4K4的相互作用，并根据各自结构域特点分别构建截短突变质粒，明确其相互作用结构域。
[0052]I)在体外，GST-pull down验证TNFRl与MAP4K4存在相互作用。
[0053 ] ①构建Hi s标记的TNFRI及GST标记的MAP4K4的原核表达载体，诱导体外表达，分离纯化 His-TNFR1&GST-MAP4K4。
[0054]②将耦合有GST-MAP4K4的Glutath1ne Sepharose 4B与纯化的His-TNFRl 共孵育，洗涤后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot检测His-TNFRl的表达，明确TNFRl在体外可以与MAP4K4相结合形成复合物。
[0055]2 )HEK293T细胞中验证TNFRl与MAP4K4存在相互作用。
[0056]①构建Myc标记的MAP4K4及HA标记的TNFRl的真核表达载体，共转入HEK293T细胞，收集细胞蛋白，分别用HA及Myc抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测Myc_MAP4K4及HA-TNFRl的表达，明确TNFRl与MAP4K4的外源性相互作用。
[0057 ] ②根据TNFRI与MAP4K4的分子结构的特征，构建TNFRI及MAP4K4的截短载体，将上述截短载体共转HEK293T细胞，免疫共沉淀联合Western Blot分析TNFRl与MAP4K4截短载体的相互作用，明确TNFRl与MAP4K4相互作用的结构域。
[0058]3)胶质瘤细胞中验证TNFRl与MAP4K4存在相互作用。
[0059]①收集H4、U87-MG及U251胶质瘤细胞，通过Western Blot在蛋白水平检测TNFRl与MAP4K4的表达。收集H4、U87-MG及U251胶质瘤细胞，通过RT-PCR在mRNA水平检测TNFRl与MAP4K4的表达。选择低表达的细胞株用于过表达实验，选择高表达的细胞株用于小干扰实验。
[0060]②选取TNFRl与MAP4K4表达差异显著的胶质瘤细胞株，收集细胞蛋白，分别用TNFRl及MAP4K4的抗体进行免疫共沉淀，并以同型IgG作为对照，Western Blot检测MAP4K4及TNFRl的表达，明确在胶质瘤细胞株中TNFRl与MAP4K4的内源性相互作用。
[0061 ]③固定胶质瘤细胞株，分别用TNFRl与MAP4K4的特异性抗体进行免疫标记，激光共聚焦显微镜下观察胶质瘤细胞中TNFRl与MAP4K4的定位情况，分析胶质瘤细胞株中TNFRl与MAP4K4的相互作用。
[0062](3)在TNF-α刺激下，干预TNFRl表达或TNFRl与MAP4K4相互作用，分别在胶质瘤细胞株及工具细胞中明确TNFRl与MAP4K4相互作用对MAP4K4磷酸化修饰的调节作用。
[0063]I)胶质瘤细胞中检测TNFRl与MAP4K4的相互作用对MAP4K4磷酸化修饰的调节及其机制。
[0064]选取高表达TNFRl的胶质瘤细胞系，予以干扰TNFRl表达;低表达TNFRl的胶质瘤细胞系，予以过表达TNFRl，同时予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，对照组不予TNF-a刺激，收集细胞蛋白，用TNFRl抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测TNFRl与MAP4K4相互作用的改变，及MAP4K4及P- MAP4K4的表达。
[0065]2)HEK293T细胞中检测TNFRl与MAP4K4的相互作用对MAP4K4磷酸化修饰的调节及其机制。
[0066]①将|^4示记的1^?41(4及浓度不同的骱标记的了即1?1表达载体共转染册1(2931'细胞，同时予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，对照组不予TNF-a刺激，收集细胞蛋白，用HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测TNFRl与MAP4K4相互作用的改变，及MAP4K4及p- MAP4K4的表达。
[0067]②将Myc标记的MAP4K4分别与HA标记的TNFRl及其截短突变表达载体共转染HEK293T细胞，予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，对照组不予TNF-a刺激，收集细胞蛋白，用HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测MAP4K4及p- MAP4K4的表达。
[0068](4)在TNF-a刺激下，干预TNFRl表达或TNFRl与MAP4K4相互作用，分析TNFRl与MAP4K4相互作用对胶质瘤细胞迀移及侵袭能力的影响。
[0069]I)在TNF-a刺激下，检测TNFRl及MAP4K4各自对胶质瘤细胞迀移和侵袭性的调节作用。
[0070]利用先前构建的TNFR及MAP4K4的过表达或小干扰质粒，转染胶质瘤细胞株，将细胞接种至Lamin包被的培养板上，予或不予TNF-a刺激，利用细胞划痕实验构建胶质瘤细胞迀移模型；接种至包被有Matrigel的8um孔径的Transwel I小室上构建侵袭模型，检测不同细胞的迀移及侵袭的能力。
[0071 ] 2)在TNF-α刺激下，检测干预TNFRl与MAP4K4的相互作用对MAP4K4及TNFRl各自调节胶质瘤细胞迀移和侵袭能力的影响。
[0072]在胶质瘤细胞中共转TNFRl的过表达载体(或小干扰质粒)及MAP4K4的过表达载体或小干扰质粒，通过细胞划痕及Transwell侵袭实验，检测不同细胞的迀移及侵袭的能力。
[0073](5)分别构建TNFRl过表达、小干扰及不与MAP4K4相互作用的突变细胞株，利用裸鼠构建胶质瘤脑内模型，明确TNFRl与MAP4K4的相互作用对动物模型中胶质瘤发生发展的影响。
[0074]分别构建TNFRl过表达、小干扰及不与MAP4K4相互作用的稳定细胞株，以I X 108密度在脑立体定位仪下注射至裸鼠皮质内，构建裸鼠胶质瘤脑内模型;4周后收集脑组织，检测肿瘤形成的大小、重量等情况，并比较其与裸鼠生存率的关系，HE染色检测肿瘤侵袭情况;获取裸鼠肿瘤组织Western Blot及免疫组化检测TNFRl及MAP4K4的表达情况;组织消化，原代细胞培养，重复实验步骤(3 )及(4 )，验证并分析TNFRl与MAP4K4的相互作用对裸鼠原代胶质瘤细胞迀移、侵袭能力的影响。
[0075]步骤2，分析MAP4K4与ARP3的相互作用及其机制，明确在胶质瘤进展中，MAP4K4通过磷酸化ARP3，激活ARP2/3复合物，促进肌动蛋白聚合及伪足形成，增强胶质瘤细胞的侵袭性。
[0076]本部分实验步骤如图8:
Cl)验证胶质瘤及正常脑组织中MAP4K4与ARP3的表达，分析两者表达的相关性，及与临床病理因素包括患者病理级别、复发及预后的相关性。
[0077]I)收集130例胶质瘤病例的病理组织石蜡标本，病例选择标准为:①有影像学明确诊断(包括CT及核磁共振);②有术后病理明确诊断;③术前无放疗、化疗及激素治疗;④组织分型和病理分级参照《2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准》。收集40组胶质瘤术后新鲜癌组织及癌旁组织，结合临床作出明确的组织分型和病理分级诊断。另取10例因急性脑外伤行内减压术所得正常脑组织标本为对照。
[0078]2)通过Western Blot和免疫组化等方法，研究不同病理分级的胶质瘤组织、胶质瘤瘤体中心组织及周边组织中MAP4K4与ARP3的蛋白表达情况，将蛋白表达情况与胶质瘤的临床因素进行相关性统计，分析MAP4K4与ARP3表达的相关性及其表达与胶质瘤患者病理级另U、复发及预后的相关性。
[0079](2)分别在胶质瘤组织、工具细胞及胶质瘤细胞中验证并分析MAP4K4与ARP3相互作用，并根据各自结构域特点分别构建截短突变质粒，明确其相互作用结构域。
[0080]I)在体外，GST-pull down验证MAP4K4与ARP3存在相互作用。
[0081 ] ①构建His标记的ARP3及GST标记的MAP4K4的原核表达载体，诱导体外表达，分离纯化HiS- ARP3及GST-MAP4K4。
[0082]②将耦合有GST-MAP4K4的Glutath1ne Sepharose 4B与纯化的His- ARP3 共孵育，洗涤后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot检测His- ARP3的表达，明确ARP3在体外可以与MAP4K4相结合形成复合物。
[0083]2)HEK293T细胞中验证MAP4K4与ARP3存在相互作用。
[0084]①构建Myc标记的MAP4K4及Flag标记的ARP3的真核表达载体，共转入HEK293T细胞，收集细胞蛋白，用Flag及Myc抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测Myc_MAP4K4及Flag-ARP3的表达，明确MAP4K4与ARP3的外源性相互作用。
[0085]②根据MAP4K4与ARP3的分子结构的特征，构建MAP4K4及ARP3的截短载体，将上述截短载体共转HEK293T细胞，免疫共沉淀联合Western Blot分析MAP4K4与ARP3截短载体的相互作用，明确MAP4K4与ARP3相互作用的结构域。
[0086]3)胶质瘤细胞中验证MAP4K4与ARP3存在相互作用。
[0087]①收集H4、U87-MG及U251胶质瘤细胞，通过Western Blot在蛋白水平检测MAP4K4与ARP3的表达。收集H4、U87-MG及U251胶质瘤细胞，通过RT-PCR在mRNA水平检测MAP4K4与ARP3的表达。选择低表达的细胞株用于过表达实验，选择高表达的细胞株用于小干扰实验。
[0088]②选取MAP4K4与ARP3表达差异显著的胶质瘤细胞株，收集细胞蛋白，分别用MAP4K4与ARP3的抗体进行免疫共沉淀，并以同型IgG作为对照，Western Blot检测MAP4K4与ARP3的表达，明确在胶质瘤细胞株中MAP4K4与ARP3的内源性相互作用。
[0089]③固定胶质瘤细胞株，分别用MAP4K4与ARP3的特异性抗体进行免疫标记，激光共聚焦显微镜下观察胶质瘤细胞中MAP4K4与ARP3的定位情况，分析胶质瘤细胞株中MAP4K4与ARP3的相互作用。
[0090](3)干预MAP4K4表达或MAP4K4与ARP3相互作用，分别在胶质瘤细胞株及工具细胞中明确MAP4K4与ARP3相互作用对ARP3磷酸化修饰的调节作用。
[0091]I)胶质瘤细胞中检测MAP4K4与ARP3的相互作用对ARP3磷酸化修饰的调节及其机制。
[0092]选取高表达MAP4K4的胶质瘤细胞系，予以干扰TNFRI表达;低表达MAP4K4的胶质瘤细胞系，予以过表达MAP4K4，收集细胞蛋白，用MAP4K4抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测MAP4K4与ARP3相互作用的改变，及ARP3和p- ARP3的表达。
[0093]2)HEK293T细胞中检测MAP4K4与ARP3的相互作用对ARP3磷酸化修饰的调节及其机制。
[0094]①将Flag标记的ARP3及浓度不同的Myc标记的MAP4K4表达载体共转染HEK293T细胞，收集细胞蛋白，用Myc抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测MAP4K4与ARP3相互作用的改变，及ARP3和P- ARP3的表达。
[0095]②将Flag标记的ARP3分别与Myc标记的MAP4K4及其截短突变表达载体共转染HEK293T细胞，收集细胞蛋白，用Myc抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及p-ARP3的表达。
[0096](4)干预MAP4K4表达或MAP4K4与ARP3相互作用，分析MAP4K4与ARP3相互作用对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迀移、侵袭能力的调节作用。
[0097]I)检测MAP4K4及ARP3各自对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迀移、侵袭能力的调节作用。
[0098]利用先前构建的MAP4K4及ARP3的过表达或小干扰质粒，转染胶质瘤细胞株，用免疫荧光检测肌动蛋白的聚合及其速度的改变;免疫荧光及光镜技术检测细胞伪足生长的改变;细胞划痕Transwel I侵袭实验，检测不同细胞的迀移及侵袭的能力。
[0099]2)检测干预MAP4K4及ARP3的表达对ARP3及MAP4K4各自调节胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迀移、侵袭能力的影响。
[0100]在胶质瘤细胞中共转MAP4K4的过表达载体(或小干扰质粒)及ARP3的过表达载体及小干扰质粒，用免疫荧光检测肌动蛋白的聚合及其速度的改变;免疫荧光及光镜技术检测细胞伪足生长的改变;细胞划痕Transwell侵袭实验，检测不同细胞的迀移及侵袭的能力。
[0101](5)分别构建MAP4K4过表达、小干扰及不与ARP3相互作用的突变细胞株，利用裸鼠构建胶质瘤脑内模型，明确MAP4K4与ARP3的相互作用对动物模型中胶质瘤发生发展的影响。
[0102]分别构建MAP4K4过表达、小干扰及不与ARP3相互作用的稳定细胞株，以I X 108密度在脑立体定位仪下注射至裸鼠皮质内，构建裸鼠胶质瘤脑内模型;4周后收集脑组织，检测肿瘤形成的大小、重量等情况，并比较其与裸鼠生存率的关系，HE染色检测肿瘤侵袭情况;获取裸鼠肿瘤组织Western Blot及免疫组化检测MAP4K4及ARP3的表达情况;组织消化，原代细胞培养，重复实验步骤(3)及(4)，验证并分析MAP4K4与ARP3的相互作用对裸鼠原代胶质瘤细胞迀移、侵袭能力的影响。
[0103]步骤3，分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体的相互作用及其机制，明确胶质瘤炎症微环境中，TNFRl通过招募并激活MAP4K4，从而磷酸化ARP3，激活ARP2/3复合物，促进肌动蛋白聚合及伪足形成，增强胶质瘤细胞的侵袭性。
[0104]本部分实验步骤如图9:
(I)工具细胞及胶质瘤细胞中验证TNFRl、MAP4K4及ARP3三者两两相互作用，并明确TNFRl与ARP3相互作用的结构域。
[0105]I)在体外，GST-pull down验证TNFRl与ARP3存在相互作用。
[0106]①构建His标记的ARP3及GST标记的TNFRl的原核表达载体，诱导体外表达，分离纯化His- ARP3及GST-TNFR1。
[0107]②将耦合有GST-TNFRl的Glutath1ne Sepharose 4B与纯化的His- ARP3 共孵育，洗涤后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot检测His- ARP3的表达，明确ARP3在体外可以与TNFRl相结合形成复合物。
[0108]2 )HEK293T细胞中验证TNFRl与ARP3存在相互作用。
[0109]①构建HA标记的TNFRl及Flag标记的ARP3的真核表达载体，共转入HEK293T细胞，收集细胞蛋白，用Flag及HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测HA-TNFR1及Flag_ARP3的表达，明确TNFRl与ARP3的外源性相互作用。
[0110]②根据TNFRl与ARP3的分子结构的特征，构建TNFRl及ARP3的截短载体，将上述截短载体共转HEK293T细胞，免疫共沉淀联合Western Blot分析TNFRl与ARP3截短载体的相互作用，明确TNFRl与ARP3相互作用的结构域。
[0111]3)胶质瘤细胞中验证TNFRl与ARP3存在相互作用。
[0112]①选取TNFRl与ARP3表达差异显著的胶质瘤细胞株，收集细胞蛋白，分别用TNFRl与ARP3的抗体进行免疫共沉淀，并以同型IgG作为对照，Western Blot检测TNFRl与ARP3的表达，明确在胶质瘤细胞株中TNFRl与ARP3的内源性相互作用。
[0113]③固定胶质瘤细胞株，分别用TNFRl与ARP3的特异性抗体进行免疫标记，激光共聚焦显微镜下观察胶质瘤细胞中TNFRl与ARP3的定位情况，分析胶质瘤细胞株中TNFRl与ARP3的相互作用。
[0114](2)分别在胶质瘤细胞及工具细胞中干预TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3复合物形成，明确TNFRl影响MAP4K4对APR3的磷酸化作用。
[0115]I)胶质瘤细胞中检测TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用对MAP4K4及ARP3磷酸化修饰的调节及其机制。
[0116]①选取高表达TNFRl的胶质瘤细胞系，干扰TNFRl表达;低表达TNFRl的胶质瘤细胞系，过表达TNFRl，予或不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，用TNFRl抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及p_ARP3的表达。
[0117]②选取高表达TNFRl的胶质瘤细胞系，干扰TNFRl表达;低表达TNFRl的胶质瘤细胞系，过表达TNFRl，予或不予TNF-a刺激，收集细胞蛋白，检测MAP4K4及p- MAP4K4表达的变化。
[0118]③若步骤②中MAP4K4的表达有变化，在②的基础上，干预MAP4K4的表达，用TNFRl抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及p_ARP3的表达是否改变。
[0119]2)HEK293T细胞中检测TNFRl、ARP3及MAP4K4的相互作用对MAP4K4及ARP3磷酸化修饰的调节及其机制。
[0120]①将Flag标记的ARP3及浓度不同的HA标记的TNFRl表达载体共转染HEK293T细胞，予或不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，用HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及P-ARP3的表达。
[0121]②将Flag标记的ARP3分别与HA标记的TNFRl及其截短突变表达载体共转染HEK293T细胞，予或不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，用HA抗体进行免疫共沉淀，WesternBlot检测ARP3及p-ARP3的表达。
[0122]③将Flag标记的ARP3及浓度不同的HA标记的TNFRl表达载体共转染HEK293T细胞，予或不予TNF-α刺激，收集细胞蛋白，检测MAP4K4及P- MAP4K4表达的变化。
[0123]④若步骤③中MAP4K4的表达有变化，在③的基础上，干预MAP4K4的表达，用HA抗体进行免疫共沉淀，Western Blot检测ARP3及p_ARP3的表达是否改变。
[0124](3)分别在胶质瘤细胞及工具细胞中干预TNFR1/MAP4K4、TNFR1/ARP3及MAP4K4/ARP3复合物形成，明确TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、细胞伪足形成及细胞迀移、侵袭能力的影响。
[0125]I)在研究方案步骤I及步骤2中，已检测TNFRl、MAP4K4及ARP3各自对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迀移、侵袭能力的调节作用。
[0126]2)在TNF-a刺激下，检测干预TNFR1/ARP3复合物的形成对TNFRl促进ARP3磷酸化，调节胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迀移、侵袭能力的影响，明确TNFRl通过促进ARP3磷酸化，来促进胶质瘤侵袭性生长。
[0127]在胶质瘤细胞中共转TNFRl的过表达载体(或小干扰质粒)及ARP3的过表达载体及小干扰质粒，予或不予TNF-a刺激，用Western Blot检测ARP3及p_ARP3的表达;免疫荧光检测肌动蛋白的聚合及其速度的改变；光镜技术检测细胞伪足生长的改变；细胞划痕及Transwel I侵袭实验，检测不同细胞的迀移及侵袭的能力。
[0128]3)在TNF-α刺激下，检测干预MAP4K4/ARP3复合物的形成对MAP4K4调节ARP3磷酸化及胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迀移、侵袭能力的影响，明确MAP4K4通过磷酸化ARP3，从而促进胶质瘤侵袭性生长。
[0129]在胶质瘤细胞中共转ARP3的过表达载体(或小干扰质粒)及MAP4K4的过表达载体及小干扰质粒，予或不予TNF-α刺激，用Western Blot检测ARP3及p_ARP3的表达;免疫荧光检测肌动蛋白的聚合及其速度的改变；光镜技术检测细胞伪足生长的改变；细胞划痕及Transwel I侵袭实验，检测不同细胞的迀移及侵袭的能力。
[0130]4)在TNF-α刺激下，检测干预TNFRl /MAP4K4复合物的形成对MAP4K4磷酸化ARP3，从而调节胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迀移、侵袭能力的影响，明确TNFRl通过招募MAP4K4，从而磷酸化ARP3，促进胶质瘤侵袭性生长。
[0131 ]在胶质瘤细胞中共转TNFRl的过表达载体(或小干扰质粒)及MAP4K4的过表达载体或小干扰载体，予或不予TNF-α刺激，用Western Blot检测ARP3及p_ARP3的表达;免疫荧光检测肌动蛋白的聚合及其速度的改变；光镜技术检测细胞伪足生长的改变；细胞划痕及Transwel I侵袭实验，检测不同细胞的迀移及侵袭的能力。
[0132]综合分析上述结果，明确TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物对胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、伪足生长及迀移、侵袭能力的调节作用及机制。
[0133]步骤4，利用胶质瘤临床病理标本及构建裸鼠胶质瘤脑内模型，在整体水平全面探讨分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体对胶质瘤在体内侵袭性生长的影响。
[0134]本部分实验步骤如图10:
Cl)综合分析胶质瘤及正常脑组织中TNFRUMAP4K4与ARP3表达的相关性及与临床相关因素包括患者病理级别、复发及预后的相关性。
[0135]I)收集130例胶质瘤病例的病理组织石蜡标本，病例选择标准为:①有影像学明确诊断(包括CT及核磁共振);②有术后病理明确诊断;③术前无放疗、化疗及激素治疗;④组织分型和病理分级参照《2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准》。收集40组胶质瘤手术新鲜组织及瘤旁组织，结合临床作出明确的组织分型和病理分级诊断。另取10例因急性脑外伤行内减压术所得正常脑组织标本为对照。
[0136]2)通过Western Blot和免疫组化等方法，研究不同病理分级的胶质瘤组织、胶质瘤瘤体中心组织及周边组织中TNFRl、MAP4K4与ARP3的蛋白表达情况，将蛋白表达情况与胶质瘤的临床因素进行相关性统计，分析TNFRl、MAP4K4与ARP3表达的相关性及其表达与胶质瘤患者病理级别、复发及预后的相关性。
[0137](2)分别构建了即1?1、1^41(4与41^3过表达、小干扰的稳定细胞株，以1\108密度在脑立体定位仪下注射至裸鼠皮质内，构建裸鼠胶质瘤脑内模型。
[0138](3) 4周后收集脑组织，检测肿瘤形成的大小、重量等情况，并比较其与裸鼠生存率的关系，HE染色检测肿瘤侵袭情况。
[0139](4)获取裸鼠肿瘤组织Western Blot及免疫组化检测TNFRl、MAP4K4与ARP3的表达情况。
[0140](5)组织消化，原代细胞培养，重复研究内容步骤3，分析并验证TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体对裸鼠原代胶质瘤细胞肌动蛋白聚合、细胞伪足形成及细胞迀移、侵袭能力的影响。
[0141]实验结果:
TNF-α是肿瘤炎症微环境中重要的炎症因子，主要通过其受体肿瘤坏死因子受体I(tumor necrosis factor receptor I，TNFR1)传导信号，在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。TNFRl由胞外区、跨膜区和胞内区三个部分构成，其胞外区与配体TNF-α结合后，TNFRl通过招募死亡结构域相关蛋白TRADD(TNF receptor-associated death domain)与其胞内区的死亡结构域相结合，募集一系列相关蛋白，如:肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF_areceptor-associated factor 2，TRAF2)、FADD(Fas_associated death domain)及受体相互作用蛋白Ureceptor interacting protein I，RIP1)等形成复合体，来实现信号传递及细胞生物学功能调控。研究显示，TNFRl的活化在胶质瘤的发生发展过程中有重要作用。TNFRl活化后，募集TRAF2及RIPl形成复合物，通过活化NF-kB途径抑制胶质瘤细胞的凋亡，促进胶质瘤的发生发展;TNFRl活化后也可通过激活下游ERK途径，从而促进胶质瘤细胞增殖。实验发现，TNFRl的蛋白表达水平与胶质瘤病例的病理分级呈正相关，且免疫组化结果显示其在复发的胶质瘤患者中有异常高表达，并对胶质瘤细胞的迀移及侵袭有促进作用(见图1，2，4)，提示TNFRl的表达与胶质瘤的侵袭性生长有关。通过蛋白质谱分析发现TNFRl与调节细胞迀移和侵袭的肌动蛋白相关蛋白3(actin-related protein 3，ARP3)有相互作用，并在胶质瘤组织中通过免疫共沉淀实验得到进一步验证(见图5)。
[0142]ARP3是一个重要的肌动蛋白相关蛋白，和其他6种肌动蛋白相关蛋白共同组成ARP2/3复合物。ARP2/3复合物作为Rho GTP酶-WASP下游的一个重要效应器可以直接调节肌动蛋白的聚合及伪足的形成，在细胞运动及肿瘤侵袭性生长过程中起到不可或缺的作用。在侵袭性生长的胶质瘤细胞中，ARP3的蛋白水平显著增加，其表达水平与胶质瘤组织的恶性程度成正比，并且侵袭能力越强的胶质瘤细胞中，ARP3的表达越高，促进伪足生长的能力越强。实验结果显示，ARP3的蛋白水平与胶质瘤病例的病理分级呈正相关，且免疫组化结果显示其在复发的胶质瘤患者中有异常高表达，进一步统计分析发现ARP3与TNFRl在胶质瘤中的表达呈正相关(见图1，2，3) ARP3的异常高表达是TNFRl促进胶质瘤侵袭性生长的重要因素之一。
[0143]实验发现，在TNF-α的刺激下，胶质瘤细胞的迀移、侵袭能力增强，ARP3的磷酸化表达增加，且ARP3的磷酸化水平与细胞侵袭相关指标的表达呈正相关(见图6XARP3的磷酸化是胶质瘤侵袭性生长的重要因素之一。
[0144]在胶质瘤中，MAP4K4与富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(proline_rich tyrosinekinase 2，Pyk2)结合，促进胶质瘤的侵袭;实验结果显示，在胶质瘤细胞中TNFRl及ARP3均与MAP4K4有相互作用(见图5)，由此可以推测，活化的TNFRl可以招募MAP4K4，并与ARP3形成复合体，但在胶质瘤中TNFRl招募的MAP4K4是否可以磷酸化ARP3，从而激活ARP2/3复合物，增强肿瘤细胞的侵袭性。
[0145]综上所述，炎症微环境中，活化的TNFRl可以招募TRAF2形成复合体结构，而TRAF2可与MAP4K4结合，调节MAP4K4的活性。MAP4K4的活化可磷酸化ARP3，激活ARP2/3复合物。ARP2/3复合物的激活可促进肌动蛋白聚合，促进伪足形成，增强细胞的运动能力。在胶质瘤中，ARP2/3复合物的活性与胶质瘤细胞的伪足形成及侵袭性成正相关。结合课题组预实验发现TNFRl可以与ARP3相互作用，并且二者在胶质瘤组织中的表达具有相关性，同时与肿瘤病理等级、复发及胶质瘤细胞的侵袭能力呈正相关;在TNF-α的刺激下，ARP3的磷酸化表达增加，且与细胞侵袭相关指标的表达呈正相关;而且TNFRl及ARP3均与MAP4K4有相互作用，这提示在胶质瘤发生发展过程中，TNFRl与ARP3的相互作用具有重要的生物学意义。
[0146]结论:
I，明确胶质瘤炎症微环境中，TNFRl通过招募MAP4K4从而促进胶质瘤细胞侵袭性增强。
[0147]2，明确在胶质瘤发展中，MAP4K4通过磷酸化ARP3，从而促使胶质瘤细胞伪足形成及侵袭性增强。
[0148]3，胶质瘤炎症微环境中，TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体胞伪足形成及侵袭性的调节作用及机制。
【主权项】
1.TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在胶质瘤侵袭性生长中的应用。2.如权利要求1所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在胶质瘤侵袭性生长中的应用，其特征为，所述TNFRl因子在胶质瘤侵袭性生长中的应用。3.如权利要求1所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在胶质瘤侵袭性生长中的应用，其特征为，所述MAP4K4因子在胶质瘤侵袭性生长中的应用。4.如权利要求1所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在胶质瘤侵袭性生长中的应用，其特征为，所述ARP3因子在胶质瘤侵袭性生长中的应用。5.TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用。6.如权利要求5所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用，其特征为，所述TNFRl因子在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用。7.如权利要求5所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用，其特征为，所述MAP4K4因子在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用。8.如权利要求5所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚体复合物在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用，其特征为，所述ARP3因子在制备治疗胶质瘤疾病药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105854020SQ201610398368
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】蔺玉昌, 张敬宁, 张燕
【申请人】无锡市第二人民医院