多靶点多肽—阿霉素复合物及其制备方法和应用
【专利摘要】多靶点多肽—阿霉素复合物及其制备方法和应用，将多肽T10?ERK溶于pH值7.8～8.2的磷酸盐缓冲液里，再将DOXO?EMCH溶于溶剂中得到溶液，所述溶剂为水与N，N’—二甲基甲酰胺的混合物，将DOXO?EMCH溶液滴加入到多肽溶液中，室温下避光搅拌反应；采用乙腈沉淀法对粗产物进行纯化，离心后制得精制品T10?ERK?DOX。本发明相比单一靶点药物具有更高肿瘤生长抑制特征，以转铁蛋白受体高表达的人乳腺癌耐药细胞MCF?7/ADR为细胞模型，以荷瘤小鼠为动物模型，T10?ERK?DOX可增强肿瘤细胞对阿霉素的摄取，提高细胞内药物浓度，降低ERK表达活性，抑制肿瘤细胞增殖，降低P?gp的表达，诱导其凋亡，抑制裸鼠移植肿瘤的生长。
【专利说明】
多靶点多肽一阿霉素复合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物与医药技术领域，具体涉及一种具有逆转乳腺癌耐药的多靶点多 肽一阿霉素复合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 阿霉素(D0X)属蒽环类化合物，是最有效的抗癌药物之一，在临床上被广泛用于治 疗急性白血病、乳腺癌、淋巴瘤以及各种实体瘤。但由于其易产生耐药性，导致阿霉素的临 床应用受到严重的限制。迄今为止，关于肿瘤细胞耐药的机制有很多，其中一种机制是ATP-结合盒转运体(ATP-binding cassette (ABC) transporter)如P-糖蛋白（P-gp)的过表达，其 能将药物外排，降低药物在癌细胞中的蓄积量。因此，目前克服耐药最普遍的方法就是通过 对抗肿瘤药物进行化学修饰来避免P-gp介导的药物外排。然而，越来越多的证据表明仅仅 通过单一靶点的修饰并不能够很好的逆转耐药，因为包括凋亡抑制等在内的多种其他耐药 机制同样会促进形成药物耐药。
[0003] 目前，大量研究表明MAPK信号通路和药物耐药息息相关。ERK作为MAPK级联反应中 关键蛋白之一，其可以激活下游基因的转录从而促进细胞生长，在凋亡耐受中起到很重要 的作用。最近的研究显示磷酸化ERK(pERK，ERK活化形式)在D0X刺激后表达会增加，与此一 致的是，耐药细胞MCF-7/ADR相比其亲本敏感细胞MCF-7，MCF-7/ADR中磷酸化ERK的表达显 著增强。因此，靶向ERK本身也成为一个具有吸引力的治疗理念。一些ERK抑制剂也已经进入 到了临床试验阶段。尽管ERK小分子抑制剂（如PD098095和U0126)已被广泛使用，但是他们 的选择性受到了质疑，主要是因为他们会和其他蛋白激酶发生ATP依赖的交叉反应。因此， 基于结构设计的且具有选择性的多肽抑制剂被研发出来，其中多肽MPKKKPTPIQLNP，为 MAPK/ERK激酶的N端序列，其能够通过影响MEK与ERK的结合来防止ERK的活化，因而能够有 效抑制ERK活性，但其同样存在一定的缺陷，即不能很好地穿过细胞膜进入细胞内而发挥作 用。
[0004] 目前通过将杂合肽和小分子药物连接起来形成多靶点药物的研究并不多，其中一 个原因可能是往往单一化学结构的物质同时对不同靶点发挥作用时，并不能达到各自的最 佳效果。因此，本设计除了对整体复合物的作用进行验证外，同样对各组成部分的对其相应 靶点的作用也分别做了验证，以及对整体作用和各部分作用进行比价。
【发明内容】
[0005] 解决的技术问题:本发明的目的是提供一种具有逆转乳腺癌耐药的多靶点多肽一 阿霉素复合物及其制备方法和应用。
[0006] 技术方案:多靶点多肽一阿霉素复合物，结构式如式I所示：
[0008] 上述多靶点多肽一阿霉素复合物的制备方法，包括以下步骤：步骤1，将多肽 骱1￥?冊66061〇31(1(砑了？10^^(1'1041?1〇溶于口11值7.8~8.2的磷酸盐缓冲液里，再将6-马来 酰亚胺基己酰基的腙衍生物(D0X0-EMCH)溶于溶剂中得到溶液，所述溶剂为水与N，N ' 一二 甲基甲酰胺的混合物，将D0X0-EMCH溶液滴加入到多肽溶液中，室温下避光搅拌反应;步骤 2，米用乙臆沉淀法对粗广物进彳丁纯化，尚心后制得精制品T10-ERK-D0X。
[0009] 上述溶剂为水与N，N'一二甲基甲酰胺的1:1体积比混合物。
[0010] 上述D0X0-EMCH与多肽摩尔比为2:1。
[0011] 上述D0X0-EMCH溶液滴加入到多肽溶液中的速率为25yL/min。
[0012] 上述避光室温搅拌时间为1.5h。
[0013]上述乙腈沉淀法条件为：乙腈和步骤1所得反应溶液的体积比为5:1;二者混合后， 4°C放置24h结晶，离心得沉淀，即为产物。
[0014] 上述多靶点多肽一阿霉素复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0015] 逆转乳腺癌耐药的药物，有效成分为式I所示的多靶点多肽一阿霉素复合物。
[0016] 上述多靶点多肽一阿霉素复合物在制备逆转乳腺癌耐药制剂中的应用。
[0017] 有益效果：1)本发明所述的T10-ERK为多肽，可化学合成，稳定性好；
[0018] 2)本发明所述的D0X0-EMCH在肿瘤酸性微环境中，腙键选择性断开，释放出药理活 性的阿霉素；
[0019] 3)选用阿霉素的6-马来酰亚胺基己酰基腙衍生物一 D0X0-EMCH，与杂合肽共价连 接，采用化学法制备多靶点多肽一阿霉素复合物;制备方法简单易行，反应速率高，耗时短， 产物的纯度和产率较高，可直接用于细胞和动物试验；
[0020] 4)本发明的多靶点多肽一阿霉素复合物通过各部分结合，达到一个综合性的效 果，相比单一靶点药物具有更高肿瘤生长抑制特征，以转铁蛋白受体高表达的人乳腺癌耐 药细胞MCF-7/ADR为细胞模型，以荷瘤小鼠为动物模型，T10-ERK-D0X可增强肿瘤细胞对阿 霉素的摄取，提高细胞内药物浓度，降低ERK表达活性，抑制肿瘤细胞增殖，降低P-gp的表 达，诱导其凋亡，抑制裸鼠移植肿瘤的生长；
[0021] 5)本发明的多靶点多肽一阿霉素复合物整体效果能综合各组成部分(如T10-D0X， T10-ERK等）的作用，并且各组成部分之间不会相互影响，能够使得各组成部分发挥最佳效 果。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明的T10-ERK-D0X的LC/MS/MS图谱;其中，A: T10-ERK-D0X的母离子图； B:T10-ERK-D0X的子离子图；
[0023] 图2为本发明的T10-ERK-D0X和游离D0X及T10-D0X对MCF-7/ADR细胞生长抑制曲 线；
[0024] 图3为MCF-7/ADR细胞对多肽一阿霉素复合物和游离阿霉素的摄取比较示意图； [0025] 图4为本发明的T10-ERK-D0X和游离D0X及T10-D0X引起的细胞凋亡情况检测示意 图；其中，分别代表DAPI染核图像，TUNEL检测凋亡的细胞图像；
[0026] 图5A为本发明的T10-ERK-D0X的组成部分T10-ERK对pERK表达的影响示意图；
[0027] 图5B为T10-ERK对细胞增殖速率的影响示意图；
[0028] 图5C为经T10-ERK处理后，细胞对D0X的摄取示意图；
[0029] 图?为T10-ERK对细胞药物(D0X)敏感性的影响；图5E为T10-ERK对细胞P-gp蛋白 表达的影响示意图；
[0030] 图6显示了本发明的T10-ERK-D0X和游离游D0X及T10-D0X对移植瘤裸鼠模型瘤体 积的抑制情况示意图。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032] 实施例1多肽-阿霉素复合物的合成及纯化 [0033] (l)TlO-ERK-DOX 的制备及纯化
[0034] 称取1.90mg的T10-ERK，溶于600yL pH 7.8~8.2磷酸盐缓冲液中，再称取1.08mg 的D0X0-EMCH，溶于600yL N，N' 一二甲基甲酰胺水溶液中，其中N，N' 一二甲基甲酰胺与水的 体积比为1:1，再以25yL/min的速率滴加入多肽溶液中，室温反应1.5h，生成T10-ERK-D0X， 向反应后溶液中加入6mL乙腈(5倍体积的反应溶液），混匀，4°C静置24h，8000 X g离心5min， 沉淀即为产物，HPLC进样，测定纯化纯度，在98 %以上。
[0035] T10-ERK-D0X 的结构式为：
[0037] 2)LC/MS/MS法和NMR法鉴定产物
[0038] LC/MS/MS法鉴定产物，采用Agilent 1200系列高效液相色谱系统和6410三重四级 杆液质联用仪，使用Waters xBridge C18(250mm X 4.6mm，5wii)色谱柱在室温下进行色谱分 离。流动相A为0.01 %甲酸-水溶液，流动相B为100 %乙腈；梯度洗脱，洗脱程序为：0~ 151^11，10~90%8;15~20111111;90%~90%8 ;20~25111111，90%~10%8;质谱系统的离子源 为电喷雾电离源(ESI);正离子扫描模式;喷雾电压4000V;雾化压力45psi ;雾化温度350°C ; 雾化气流l〇L/min;检测方式为全扫描(Full Scan)和子离子扫描(Product Scan)，采集时 间设在200ms;传输电压设为120V，碰撞能分别设为30eV，所有数据均通过Agilent MassHunter工作站软件(B ? 01 ? 04版)采集和处理。
[0039] T10-ERK-D0X母离子图见图 1(A)，ESI-MS/MS m/z:1696[M+2H]2+，1131 [M+3H]3.， 848[M+4H]4+和679[M+5H]5+。当碰撞能设置为30eV时，可见质谱碎片特征。如图1(B)所示， T10-ERK-D0X含有肽段序列特异性的b离子(m/z 137(bl)，m/z 209(b2)，m/z 322(b3))，以 及DOX特征碎片(m/z 376)，可以验证该产物的合成。
[0040] MTT法测定细胞存活率试验
[00411 将状态良好的MCF-7/ADR细胞消化，用培养液稀释至2 X 104cells/mL细胞密度，吹 匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液200yL，置37 °C、5 %二氧化碳环境中孵育24h，使其贴壁。 换用200yL DOX、T10-D0X和T10-ERK-D0X含药培养液，每个浓度设5个平行孔，同时设置空白 对照组，均置于培养箱中孵育48h，再向每孔加入MTT液(5mg/mL) 20yL，继续培养4h，吸去培 养液，加入DMSO 150yL，室温下微孔板震荡器上震荡30min，在酶联免疫检测仪490nm下测定 各孔吸光值。以对照细胞为100%，以给药组的细胞存活相对于对照细胞存活的百分率来测 定其存活率。
[0042] 通过MTT方法考察三种药物对MCF-7/ADR肿瘤细胞的细胞毒性作用，绘制细胞存活 率曲线，计算IC5Q值，评价药物的体外细胞毒性。如图2所示，D0X和T10-D0X的IC5Q值分别为 41.5±1.0虚和33.5±1.0福，而!'10-￡狀-00父的1〇5()分别为20.8±1.1福，说明相比00父和 T10-D0X，MCF7/ADR 细胞对 T10-ERK-D0X 更敏感。
[0043]细胞内阿霉素蓄积实验
[0044] MCF-7/ADR细胞以1X105/孔的密度接种于6孔培养板中，置37°C、5%二氧化碳环 境中孵育24h后，加入DOX、T10-D0X和T10-ERK-D0X，终浓度为1.5yM，药物作用12h。吸弃含药 培养液，用冷洗细胞3次，荧光显微镜下观察各组处理细胞，结果见图3JCF-7/ADR细胞 经过不同的给药处理后，T10-D0X和T10-ERK-D0X组细胞内的荧光强度明显高于D0X组，而 T10-ERK-D0X 略微高于T10-D0X 组。
[0045] 缺口末端标记(Tune 1)法检测细胞凋亡
[0046] 将2X107/mL密度的细胞制成细胞涂片后，用4%多聚甲醛/PBS液，4°C固定20min。 加入20yg/mL的蛋白酶K 100yL作透化处理，室温孵育5min，PBS洗涤3次。滴加100yL平衡液， 室温孵育30min，再加入TdT孵育缓冲液20yL，37 °C温育lh，PBS洗涤后，再用DAPI复染，荧光 显微镜下分析样品，结果如图4所示，DAPI染核呈蓝色，凋亡细胞呈绿色。
[0047] 凋亡检测结果如图4所示。D0X和T10-D0X组的细胞凋亡率分别为21.7%和43.2%， 而T10-ERK-D0X组凋亡率明显增高，为48.5%。
[0048] T10-ERK对ERK介导的耐药的影响
[0049] 将MCF-7/ADR细胞分别暴露于100處溶于无血清培养液的T10和T10-ERK 24h，通过 western bloting检测细胞内pERK及总ERK的表达。图5A表明经T10-ERK给药后，pERK的表达 显著降低，而ERK表达无变化，而T10组及空白对照组pERK及总ERK均无明显变化。
[0050]将T10和T10-ERK分别溶于含血清的培养液中，得10yM加药培养液，以此培养液培 养细胞。培养一周后，以MCF-7/ADR每孔5XHT4密度接种于六孔板中，每天进行细胞计数， 观察细胞增殖速度。同时在给药结束后，对各组细胞摄取阿霉素能力及对D0X的敏感性进行 检测(方法同上述细胞内阿霉素蓄积实验和MTT法测定细胞存活率试验）。结果如图5B和5C， T10-ERK组细胞增长速度减慢，且对阿霉素的摄取能力增加。图5D表明，经T10-ERK刺激后， MCF-7/ADR细胞对D0X的敏感性提高，IC 5Q值为33.0 ± 1.0虚，而T10和control组并无差异， ICso 值分别为 38 ? 4± 1 ? OyM 和 39 ? 7 ± 1 ? OyM。
[0051 ] 以上述10yM加药培养液对MCF-7/ADR细胞给药两周后，对其P-gp表达通过细胞流 式仪进行检测。图5E表明，T10-ERK组细胞的P-gp表达降低，而T10和空白对照组并无明显差 异。
[0052]体内抗肿瘤活性
[0053] 将处于对数生长期的MCF-7/ADR乳腺癌细胞，用roS调制细胞混悬液至细胞数为1 XioVmL，以每只O.lmL接种于小鼠右侧腋窝皮下，建立鼠乳腺癌瘤株腋下接种模型。
[0054]接种7-14天，待肿瘤体积生长至50-100mm3,对荷瘤小鼠进行尾静脉注射给药。将 荷瘤小鼠随机分成4组(每组6只），分别为模型对照组(生理盐水）、D0X、T10-D0X和T10-ERK-D0X组，对照组尾静脉给予生理盐水，其余各组分别尾静脉注射给予相应药物，每隔5天给药 1次，连续给药5次，给药剂量为3mg D0X/kg鼠重，其中T10-D0X和T10-ERK-D0X组需以D0X为 有效成分，经换算后再按3mg D0X/kg鼠重标准给药。
[0055]给药后，每天观察小鼠的存活状态，用游标卡尺测量肿瘤体积。待各给药组与荷瘤 对照组间的肿瘤体积存在明显差异后，结束观察。处死小鼠，称瘤重，计算抑瘤率。
[0056] 如图6所示，D0X、T10-D0X和T10-ERK-D0X组均能一定程度上抑制肿瘤体积的增长， 呈现一定的抗肿瘤活性，D0X和T10-D0X组抑瘤率分别为45.7 ± 2.8 %和63.0 ± 3.1 %，而 T10-ERK-D0X平均抑瘤率明显增加(p〈0.05)，为72.2 ±4.6%。
[0057]综上，利用D0X0-EMCH马来酰亚胺基团上的双键可与多肽上游离的巯基共价连接 的性质，我们设计了多肽T10-ERK，与D0X0-EMCH发生加成反应，形成T10-ERK-D0X多靶点复 合物，其相比单一靶点药物增加了药物在肿瘤细胞的富集，抑制癌细胞增殖，促进凋亡，降 低ERK活性，降低P-gp的表达，提高了药物疗效，逆转了药物耐药。
[0058]以上实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 多靶点多肽一阿霉素复合物，其特征在于结构式如式I所示：2. 权利要求1所述多靶点多肽一阿霉素复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 步骤1，将多肽HAIYPRHGGCGMPKKKPTPIQLNP(T10-ERK)溶于pH值7.8~8.2的磷酸盐缓冲液 里，再将6_马来酰亚胺基己酰基的腙衍生物(DOXO-EMCH)溶于溶剂中得到溶液，所述溶剂为 水与N，N ' 一二甲基甲酰胺的混合物，将DOXO-EMCH溶液滴加入到多肽溶液中，室温下避光搅 摔反应;步骤2，米用乙臆沉淀法对粗广物进彳丁纯化，尚心后制得精制品TIO-ERK-DOX。3. 根据权利要求2所述多靶点多肽一阿霉素复合物的制备方法，其特征在于所述溶剂 为水与N，N'一二甲基甲酰胺的1:1体积比混合物。4. 根据权利要求2所述多靶点多肽一阿霉素复合物的制备方法，其特征在于所述DOXO-EMCH与多肽摩尔比为2:1。5. 根据权利要求2所多靶点多肽一阿霉素复合物的制备方法，其特征在于所述DOXO-EMCH溶液滴加入到多肽溶液中的速率为25yL/min。6. 根据权利要求2所述多靶点多肽一阿霉素复合物的制备方法，其特征在于所述避光 室温搅拌时间为1.5h。7. 根据权利要求2所述多靶点多肽一阿霉素复合物的制备方法，其特征在于所述乙腈 沉淀法条件为：乙腈和步骤1所得反应溶液的体积比为5 :1;二者混合后，4°C放置24h结晶， 离心得沉淀，即为产物。8. 权利要求1所述多靶点多肽一阿霉素复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。9. 逆转乳腺癌耐药的药物，其特征在于有效成分为权利要求1式I所示的多靶点多肽一 阿霉素复合物。10. 权利要求1所述多靶点多肽一阿霉素复合物在制备逆转乳腺癌耐药制剂中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105854025SQ201610202840
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】陈芸, 尤雯, 尤一雯, 盛媛
【申请人】南京医科大学