一种用于检测塑化剂的酶联免疫试剂盒的制备
【技术领域】
[0001]本发明属于检测技术领域，具体地涉及一种用于定量检测白酒样本中的塑化剂(DBP)残留量的酶联免疫试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]塑化剂是一种增加材料的柔软性或是材料液化的添加剂。邻苯二甲酸酯类塑化剂被归类为疑似环境荷尔蒙，其生物毒性主要属雌激素与抗雄激素活性，会造成内分泌失调，损害生物体生殖机能，包括生殖率降低、流产、天生缺陷、异常的精子数、睾丸损害，还会引发恶性肿瘤、造成畸形儿，导致儿童性早熟。
[0003]邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)是一种常用的塑化剂，也用作胶粘剂和印刷油墨的添加剂，也可用作一种杀体外寄生虫药。它具有较强的生殖毒性，可引起男性生育能力下降，尤其对儿童的毒性更大。DBP主要存在于人造革、塑料制品、化妆品、香精及农药中。
[0004]目前，检测塑化剂的方法主要有高效液相色谱法HPLC、气相色谱法GC等。其中，高效液相色谱法HPLC、气相色谱法GC是定量的检测方法，结果准确可靠，缺点是检出限较高、仪器设备较为昂贵，以及复杂的样本前处理方法，限制了该方法的广泛应用。酶联免疫吸附ELISA法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用。本发明旨在建立一种检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的制备及检测方法。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中存在的问题，本发明提供了检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。本发明提供了一种用于检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的制备。
[0006]检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的制备，包括酶标板、塑化剂(DBP)标准品、塑化剂(DBP)酶标抗体工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。
[0007]检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的制备，包括以下步骤:酶标板的制备、塑化剂(DBP)标准品的制作、塑化剂(DBP)酶标抗体工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。
[0008]其进一步特征在于:所述的塑化剂(DBP)包被抗原是将塑化剂(DBP)半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将塑化剂(DBP)抗原稀释成1:30000比例，100 μ?7孔，37°C放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μ?/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.3%牛血清白蛋白(BSA)封闭，160 μ?7孔，37°C放置2 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C )晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。
[0009]所述的塑化剂(DBP)标准品浓度分别为0 ppm、0.05 ppm、0.15 ppm、0.45 ppm、1.35 ppm、4.05 ppm。
[0010]塑化剂(DBP)酶标抗体工作液的制备:采用辣根过氧化酶偶联塑化剂单克克隆抗体所得到，该酶标抗体工作液用抗体稀释液稀释成1:20000。
[0011 ] 所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
[0012]塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的检测方法，基于抗原抗体进行直接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤:
(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；
(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20?25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(3)取包被有塑化剂(DBP)抗原的酶标板，加标准品/样本50μ?7孔到对应的微孔中；
(4)加入酶标抗体工作液，50μ?7孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min ；
(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300μ?7孔，充分洗涤4次，浸泡15-30 s,用吸水纸拍干；
(6)加入底物液A50 μ?ν孔，底物液B 50 μ?ν孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15 min ；
(7)加入终止液50μ?/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)；
(8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中塑化剂(DBP)的含量。
[0013]其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品:
取5 mL样品于干净的玻璃试管中，加入2mL色谱纯的正己烷，盖上盖后振荡3 min，然后静置，待分层后取上层清液1 mL，于干净的玻璃器皿室温氮气吹干，吹干后用lmL 35%的甲醇复溶后待测。
[0014]本发明采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法来检测。用于检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的测定原理:样品中的塑化剂(DBP)与酶标板上固定的抗原特异性竞争酶标抗体，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中塑化剂(DBP)的含量。如果样品中的塑化剂(DBP)含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的检测。
【附图说明】
[0015]图1为塑化剂(DBP)标准曲线图。
【具体实施方式】
[0016]检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒，其包括酶标板、塑化剂(DBP)标准品、塑化剂(DBP)酶标抗体工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。
[0017]下面具体描述本发明中检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒的制备，
塑化剂(DBP)蛋白质偶联物的制备:
将塑化剂(DBP)半抗原与载体蛋白BSA按12:1的结合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，然后加入入碳二亚胺，搅拌1?2h，置室温反应24 h，最后用0.2mol/L pH 7.6的PBS透析两天，除去未反应的半抗原，即可得到塑化剂(DBP)蛋白质偶联物。
[0018]塑化剂(DBP)抗体的制备:
选用3月龄健康大白兔，通过三次免疫，每次塑化剂(DBP)蛋白质偶联物免疫原用量为50 μδ/0.05 mL，每次免疫间隔时间为2周。初次免疫分别将免疫抗原与费氏佐剂及不安全佐剂等量混合，劲部皮下多点注射，二次、三次免疫直接注入腹腔。融合前3天每只腹腔注入25 Pg塑化剂(DBP)蛋白质偶联物进行加强免疫，免疫后第6 d耳静脉取血，采用直接竞争ELISA法测定效价。取得较高效价后用半抗原直接在大腿肌肉注射，8 d后颈动脉采全血，分离抗血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，制成冻干粉后于-20°C保存备用。
[0019]制备辣根过氧化物酶标记塑化剂单克隆抗体:采用过碘酸盐氧化法。
[0020]制备包被有塑化剂(DBP)包被抗原的酶标板:
酶标板包被塑化剂(DBP)抗原，包被抗原是将塑化剂(DBP)半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将塑化剂(DBP)抗原稀释成1:30000比例，100 μ?7孔，37°C放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μ?7孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.3%牛血清白蛋白(BSA)封闭，160 μ?7孔，37°C放置2 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C )晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。
[0021]所述的塑化剂(DBP)标准品配制浓度分别为0 ppm、0.05 ppm、0.15 ppm、0.45ppm、1.35 ppm、4.05 ppmD
[0022]所述的塑化剂(DBP)酶标抗体工作液的制备:采用辣根过氧化酶偶联塑化剂单克克隆抗体所得到，该酶标抗体工作液用抗体稀释液稀释成1:20000。
[0023]所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
[0024]基于上述制备的试剂，本发明用于检测塑化剂(DBP)的ELISA试剂盒包括如下材料:
(1)96孔酶标板XI块；
(2)标准液X 6 瓶:(lm