用于预测小肝癌复发的联合诊断标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一组肿瘤诊断标志，特别涉及用于预测小肝癌复发的联合诊断标记。
【背景技术】
[0002] 肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，发病率居世界第6位，死亡率居第三位，每 年约有25万人死于肝癌。肝癌由于起病隐匿，恶性程度高，治愈率低，是严重威胁人类健 康和生活质量的恶性肿瘤之一，且肝癌的发病率每年都在持续地上升。中国是全世界肝癌 每年新增病例最多的国家，占全世界总发病率的一半，且欧美国家发病率虽不高但也在逐 年增加。肝细胞性肝癌（heptocellular carcinoma, HCC)是肝癌最主要的组织学类型，占 原发性肝恶性肿瘤的70% -85%，在我国更是占到了约90%。迄今为止，HCC的发病机理 仍然不明确，但病毒感染、黄曲霉素 Bl摄入和酗酒等被认为是HCC主要的致病因素。其中 10% -40%慢性B型肝炎病毒携带者最终将发展为肝细胞癌，全世界每年估计超过1百万 患者死于B型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV)和C型肝炎病毒相关的肝癌。在中国 和日本，75 % -80% HCC发病与肝脏慢性病毒感染关系密切，其中B型肝炎病毒感染率占 50% -55%，而世界范围内80% -90%的HCC病例合并有肝硬化。因此，肝脏HBV感染及肝 硬化是HCC最主要的高危因素和癌前病变过程。
[0003] 近年来，随着分子生物学技术及影像学技术的发展，对肝癌的早期诊断及治疗取 得了很大进步，使肝癌的临床诊断和治疗效果均得到明显改观。根据中华医学会外科学 肝脏外科学组2001年制定的标准，将单发直径< 2cm的肝癌定为微小肝癌，单发的直径 > 2cm且< 5cm的肝癌为小肝癌。而临床病理学上定义小肝癌为单个或两个癌结节直径 < 3cm。临床病理研究资料证实：3cm以上的小肝癌预后相对较差，门脉癌栓及卫星结节发 生率都较高，而< 3cm的小肝癌则组织学分化较好，肿瘤多数有包膜，DNA含量大多为二倍 体，少见癌栓和卫星灶，这些提示肿瘤在3cm以下是生物学特性发生明显改变的主要时期。 从20世纪70-80年代起，随着血清甲胎蛋白（AFP)、实时超声显像和CT的广泛应用，大大提 高了肝癌的早期诊断率，很多小肝癌病例在临床被发现。小肝癌多属于早期肝癌，一直是肝 癌临床研究的热点。小肝癌的治疗主要强调根治性，手术切除被认为小肝癌根治性治疗的 "金标准"，是小肝癌的首选治疗手段。但小肝癌术后5年生存率仍停留在50% -60%之间， 始终没有重大的突破，术后复发及转移仍然是小肝癌预后不良的主要原因。
[0004] 肝癌复发的来源一是多中心发生，即肝癌根治性切除后，由于肝癌生长的土壤 (肝硬化）和其它促癌因素的继续存在，再发新的肿瘤；二是单中心发生，即原先切除病灶 术前、术中癌细胞经门静脉途径播散，发生肝内复发和肝外转移。目前对影响肝癌术后预后 因素的研究，主要集中于对肿瘤大小、数目、分化程度、脉管侵犯、甲胎蛋白水平等临床病 理因素的分析，而这些对肝癌肝切除后的复发尚不能进行较准确的预测。因此，针对肝癌 复发这一科学难题，如何对切除术后肿瘤复发进行有效的预测，如何预防肝癌术后的肿瘤 复发均对提高肝癌的疗效有重大的临床意义，探索和建立简单、快速、敏感性高和特异性强 的分子预测指标和新的治疗靶点已成为提高临床疗效的迫切需要。
[0005] 肝癌的复发是一个多步骤、多因素参与的复杂过程，涉及到肿瘤细胞黏附、细胞外 基质降解、细胞迀移、细胞增殖、肿瘤血管形成等肿瘤生物学各个方面，不能单独仅从一方 面来分析肝癌复发。肝癌的复发与临床病理分期、肿瘤包膜、肿瘤大小、数目、血管浸润及肝 硬化程度等有关，这些结果只是建立在肝癌临床病理和细胞水平观察和研究的基础上，很 难在小肝癌（尤其是单结节）复发之前对其复发倾向早期做出个体化的预测。近年来的研 究发现影响肝癌复发转移基因、蛋白在其生物学行为中起着重要作用，但是当前的大多数 研究为单因素研究模式，集中研究一个或少数几个基因、蛋白的表达情况，单单仅凭一个或 少数几个基因、蛋白的表达情况无法确切反映肝癌转移的分子生物学特征，因此应该进一 步采用多因素联合的方法综合分析肿瘤侵袭转移相关的多个指标与小肝癌复发的关系，辨 别各相关指标间的内在联系，从而建立一个合适的模式来预测小肝癌患者术后的复发。
[0006] 最近，部分研究发现基因表达标签、表观遗传分子标记和microRNA能够很好预测 肝癌患者的复发及预后。然而，这些基于基因标签的检测由于实验室平台、新鲜组织获取、 重复性、检测费用和方法推广等原因使其很难在临床上广泛应用。而免疫组化检测方法因 其操作简易、应用广、费用低、定性灵敏度高、定位直接准确等因素得到研究者的青睐，被用 于各种肿瘤的分子分型，包括肝细胞癌。以上的这些研究都是基于大小肝癌病例得到的结 果，而小肝癌的生物学特性与大肝癌存在着一定的差异，对于小肝癌（尤其是HBV阳性的单 发直径< 3cm)这一特殊亚群却还没有很好预测患者复发的相关报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提及一种用于预测小肝癌复发的联合诊断标记，该标志对小肝 癌的复发有很好的预测价值。
[0008] 发明人通过对大量病例进行分析，在训练组病例，LASSO Cox回归模型确立并构 建了基于6基因标签（包括⑶147、IL-7、Ki67、MIF、P97及H)-L1)的小肝癌复发预测模 型；6基因标签分类器定义的高复发风险人群与低复发风险人群的危险比为2. 721 (95% Cl: 1. 633-4. 532 ;P〈0. 0001);对内部验证组队列（167例）进行同样的分析也得到类似的 结果。为了验证6基因标签分类器在不同人群是否有同样的预测效能，发明人将该分类器 应用于来自不同中心的包含有347例小肝癌的独立外部验证组队列中。发现： 1) 分类器定义的高复发风险人群与低复发风险人群的危险比为1.868(95 % Cl :1, 334-2. 617 ；P<0. 0001)； 2) 通过排除临床病理参数的协同作用，多变量生存分析结果显示6基因标签分类器是 一个影响小肝癌复发的强大的独立预后因素，无论是在训练组和内部验证组，还是在外部 验证组都得到类似的结果（P〈〇. 0001); 3) 分层生存分析结果显示6基因标签分类器仍然是小肝癌临床上和统计学上有显著 意义的预后模型；ROC曲线分析显示6基因标签分类器在预测小肝癌复发方面比临床临床 危险因素具有更好的准确度（AUC :0. 686vs 0. 606); 4) 联合6基因标签分类器与临床病理高危因素能提高参数的预后预测价值（AUC = 0.703);通过构造两个集6基因标签分类器和临床高危因素于一体的列线图：AFP阴性组和 AFP阳性组；刻度尺图显示AFP阴性组的列线图的预测效果更好；时间依赖的ROC曲线分析 显示列线图在AFP阴性的患者有更高的预测准确度。
【附图说明】
[0009] 图1是免疫组化检测30个基因标签在小肝癌组织的表达情况； 图2是X-tile分析软件确定30个基因标签免疫组化表达的分界值；X-tile软件将病 例分为两亚组进行log-rank检验，其检验产生的卡方值如左边所示；X-tile软件将所有病 例根据基因标签的表达分为蓝和灰色两组（中间方形图，X轴表示标记物的表达分数，Y轴 表示病例数）；右边显示Kaplan-Meier生存曲线图； 图3是构建基于6个生物标签的小肝癌预后分类器；(A) 30个肝癌相关的生物标签 LASSO系数分布概况：垂直线显示的是由10倍交叉验证确定的阈值；(B)LASSO模型的调优 参数选择的Ten-time交叉验证：垂直实线代表部分似然偏差土 SE (标准误），垂直虚线代 表通过最小标准和I-SE标准获得的最佳值； 图4是训练组、内部验证组及外部验证组的基于6基因标签分类器的风险分数、时间依 赖的ROC曲线和Kaplan-Meier生存曲线； 图5是根据6基因标签分类器检测682例小肝癌患者的临床病理参数分层的 Kaplan-Meier 生存分析； 图6是根据6基因标签分类器检测682例小肝癌患者的临床病理参数分层的 Kaplan-Meier 生存分析； 图7是ROC曲线比较6基因标签分类器、临床病理参数及单个基因标签的预测准确度； 图8是列线图预测AFP阴性和AFP阳两组小肝癌患者的肿瘤复发风险。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
[0011] 样本资料 收集连续的病理确诊及手术切除的非转移性小肝癌病例682例。其中来自于中山大学 附属肿瘤医院病理科1998年12月至2008年12月期间病理确诊小肝癌335例。按电脑生 成的分配顺序随机将335例中山大学附属肿瘤医院的小肝癌病例分为：培训组168例，内部 验证组167例。内部验证后，又收集了 2000年7月至2009年9月期间其他医院确诊的小 肝癌347例作为一个独立外部验证组。只有原发性手术切除的小肝癌（非射频消融或肝移 植）病例才纳入本研究。纳入标准包括：肿瘤单发，肿瘤直径< 3cm，血清HBV阳性，首次治