疗为手术切除，没有转移和肿瘤残留，术前未行辅助治疗，有完整的随访资料。所有病例标 本均经10%福尔马林固定、石蜡包埋，切片作常规H&E染色。所有病例都重新进行病理组织 学评估，组织学分级参照Edmonson和Steiner标准。
[0012] 随访 手术切除后病人常规地在门诊进行随访，随访间隔为2-6月，随访项目包括血清AFP、 腹部B超和胸部X光片。随访过程当怀疑肿瘤复发时则进一步行CT和MRI检查，必要时行 穿刺活检进行病理确诊。无复发生存期定义为手术日期至肿瘤首诊复发日期的时间间隔。 肿瘤特异的总生存期定义为手术日期至病人死于肝癌或最后随访日期的时间间隔。
[0013] H&E 染色 采用常规H&E染色方法进行形态学观察评价肿瘤分级、肿瘤包膜、肿瘤是否坏死、肿瘤 血管浸润情况及组织芯片典型区域定位。
[0014] 组织芯片制作 (1)制作"受体"蜡块 将徕卡LEICA PARAPLAST*HM的石蜡用模具制成大小约为4. OcmX 2. 5cmX I. 5cm的"受 体"蜡块，并用修蜡机将蜡块表面修平备用。
[0015] (2)选择"供体"组织 显微镜下选择病变典型部位并在玻片上做好标记，然后将切片和石蜡组织块进行匹 配，根据玻片病灶位置在石蜡组织块上作相应的标记。
[0016] (3)制作组织芯片方阵 将制作好的"受体"蜡块固定在组织芯片制作机上的蜡块槽内，用组织芯片机上的细穿 刺针头在"受体"蜡块打洞，用粗针头从"供体"蜡块中取出所需组织，插入"受体"蜡块的洞 内。重复以上步骤，逐一将所选蜡块组织插入"受体"蜡块中，排列成微组织阵列，即制成芯 片蜡块。（4)芯片蜡块切片用组织切片机对组织芯片蜡块进行连续切片，厚度约4um，将制 作好的切片作H&E染色，检查所制作的微阵列是否与所设计阵列中的组织排列一致以及是 否含有肿瘤组织。
[0017] 免疫组织化学染色 采用EnVision二步法进行免疫组织化学染色： 1) 3-5 μ m石蜡切片56°C温箱烤片过夜； 2) 二甲苯脱蜡及梯度酒精水化； 3) 蒸馏水漂洗1分钟； 4) 0. 3%氏02室温浸泡10分钟，以阻断内源性过氧化物酶； 5) 蒸馏水漂洗1分钟； 6) 抗原修复： 所有抗原的修复全部采用高压修复法：将适量的抗原修复液（工作液）（每种抗体所使 用的修复液详见表4)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。将切片放置于修复液中，待高压锅 加帽出气后，低火维持2:30分钟，将压力锅端离热源，冷却至室温； 7) pH7. 2-7. 4PBS缓冲液漂洗1分钟； 8) 用羊血清孵育30分钟以去除非特异性着色； 9) 滴加一抗，室温孵育过夜； 10) pH7. 2-7. 4PBS缓冲液漂洗（2分钟X5); 11) 滴加 EnVision二抗，室温孵育60分钟； 12) pH7. 2-7. 4PBS缓冲液漂洗（2分钟Χ5); 13) DAB显色2-10分钟，清水冲洗终止反应； 14) 苏木素复染1-2分钟，盐酸酒精分化1-3秒； 15) 流水中充分冲洗； 16) 37 °C温箱烤片，二甲苯透明，中性树胶封片。
[0018] 免疫组化结果评价 30个基因标签的评分使用半定量方法：计算阳性肿瘤细胞占总肿瘤细胞的比例乘以 其染色强度。肿瘤细胞染色所占的百分比被分为半定量的五级分级系统：〇分为所有的肿 瘤细胞均未染色；1分为I %到10%的肿瘤细胞被染色；2分为11 %到25%的肿瘤细胞被 染色；3分为26 %到50 %的肿瘤细胞被染色；4分为51 %到75 %的肿瘤细胞被染色；5分为 76%以上的肿瘤细胞被染色。染色强度使用半定量的4级评分系统：0为没有染色；1为弱 染色；2为中度染色；3为强的染色。免疫组化结果由两位不知道病人临床病理资料的病理 医生评分产生。当两位病理医生的结果一致时，评分的最终结果由第三位病理医生共同商 量讨论后决定。
[0019] 免疫组化分界值的选择 免疫组化评分最佳的分界值由X-tile分析软件（3. 6. 1版本，耶鲁大学医学院）确定， X-tile分析软件是基于每一基因标签的表达分数与患者无病生存之间的关系计算得到。 X-tile软件提供了一个较直观的方法评估变量和患者生存之间的关系。X-tile软件能够 根据Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验计算其最大的卡方值（即最小p值）进而自 动选择变量最优的分界值。
[0020] LASSO回归分析 LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator)是一种流行的高维预测 的回归方法。它通过构造了一个惩罚数得到一个较为精炼的模型，同时它收缩一些系数，并 设定一些系数为零。LASSO是一种处理具有复共线性数据的有偏估计的方法，通过回归系数 的绝对值最小以及残差二乘和最小，得到一个折中岭回归和子集选择的回归方法。这种方 法被扩展和广泛应用于高维数据生存分析的Cox比例风险回归模型。在训练组病例，发明 人应用LASSO Cox回归模型选取与小肝癌联系紧密而有用的预后标志物，并构建了一个多 基因标签为基础的预测小肝癌复发的模型（R软件，版本3. 0.1 ;"glmnet"软件包）。
[0021] 统计学分析 比较两组数据差异连续变量使用t检验和分类变量采用卡方检验。发明人使用 Kaplan-Meier方法分析变量与小肝癌无复发生存之间的相关性，应用log-rank检验分析 生存曲线。发明人应用时间依赖的ROC曲线分析临床病理参数及多生物标签为基础分类机 的准确度。发明人使用Cox回归模型进行多变量生存分析，Cox回归系数做成列线图。应 用刻度尺探讨列线图的特性性能。时间依赖ROC分析由R软件"survival R0C"数据包完 成，列线图和刻度尺利用R软件rms数据包完成，而其他的统计则由3. 0. 1版本R软件完成。 当双侧P值小于〇. 05时认为有统计意义。
[0022] 3. 1病人临床病理特征 发明人对682例手术切除、病理确诊的小肝癌病例进行基因表达特征检测。所有患者 均为长期的乙型肝炎病毒携带者和首次手术切除治疗的患者。其中275例患者手术后经历 肿瘤复发，中位复发时间为38. 5个月。当前研究五百四十五肝癌标本被收购了。表2. 2总 结了本研究中三组小肝细胞癌患者的临床病理特点。三组病例的临床病理特点和RFS率没 有明显差异（表2. 2)。患者最常见的死亡原因是肿瘤复发、转移或严重的肝硬化。确诊复 发患者的后续治 表2. 2小肝癌患者的临床病理特征
*P值通过对比训练组与验证组之间的差异获得。
[0023] 3. 2候选基因标签在小肝癌组织的表达情况 根据以往的文献报道，发明人选取30个与肝癌发生发展相关的基因标签进行免疫组 化检测。30个基因标签在肝细胞癌组织IHC典型的表达情况如图1所示。根据发明人以前 的研究，为了让每个标记物的预测价值最大化，发明人应用X-tile软件确定训练组中每个 基因标签的分界值。X-tile软件通过分析变量与患者生存的关系确定变量单一的、直观的 分界值，X-tile软件能够根据最大的卡方值和最小的P值自动选择变量的分界值。X-tile 分析软件确定30个基因标签免疫组化表达的分界值（图2) :X-tile软件将病例分为两亚 组进行log-rank检验，其检验产生的卡方值如左边所示；X-tile软件将所有病例根据基 因标签的表达分为蓝和灰色两组（中间方形图，X轴表示标记物的表达分数，Y轴表示病例 数）；右边显示Kaplan-Meier生存曲线图。
[0024] 在训练组队列，通过X-tlie软件分析30个基因标签表达评分与小肝癌患者RFS 的相关性，从而确定各个基因标签的分界值，根据训练组获得的分界值又被引入内部验证 组和独立外部验证组进行验证，各个标记物的分界值及相关验证组结果如表2. 3所示。
[0025] 表2. 3各个基因标签表达的分界值及其验证结果
[0026] 3. 3构建基于6基因标签的小肝癌复发风险模型 在训练组队列，发明人应用LASSO Cox回归模型建立小肝癌复发的预后模型。LASSO使 用Ll惩罚地缩小一些回归系数为零。λ惩罚参数，也称调优参数，控制着收缩的量：λ值 越大，选择的预测因子数量就越少。LASSO回归已经扩展并广泛应用于生存分析与高维数据 的Cox比例风险回归模型。LASSO可用于高维基因微阵列数据的最优选择，这些微阵列数 据由于具有强大的预后意义和彼此变量间的低相关性可以防止过度拟合。发明人采用惩罚 Cox回归模型与LASSO处罚同时达到收缩和选择变量的目的。Ten-time交叉验证被用来确 定λ的最佳值。发明人通过1-标准误原则选择λ值：最佳λ值是对于那些部分似然偏差 在部分似然偏差最小值的一个标准误内的最大值。本研究中，发明人通过部分似然偏差与 Iog(A)进行画图，而λ为调优参数（图3KLASS0 Cox回归模型确立了 6个与小肝癌复发 相关的基因标签：包括〇)147、11^-7、灯67、1正、？97及1^-1^1(图3)。图3中，仏)30个肝癌 相关的生物标签LASSO系数分布概况：垂直线显示的是由10倍交叉验证确定的阈值；(B) LA