降低的血管渗漏综合征的细胞因子衍生治疗的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关专利申请的夺叉引用
[0002] 本国际专利申请要求于2013年4月19日提交的欧洲专利申请EP13002066. 2的 权益，该申请以引用的方式并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及一种用于治疗受试者的癌症和/或感染的新的药物组合物及相关方 法。
【背景技术】
[0004] 在过去几十年里，已经发展了免疫疗法来克服免疫系统不能有效防范肿瘤或微生 物的建立或有效排斥已建立的肿瘤或微生物的缺点。
[0005] 在众多免疫疗法中，人们特别感兴趣的是基于细胞因子的免疫疗法。这些为可溶 性分子的分子调节体液和/或细胞免疫。在这些分子中，人们更感兴趣的是IL-2、IL-7、 IL-12和IL-15,这是由于这些分子诱导NK细胞的存活和/或增殖，因此其作为用于治疗感 染或癌症的佐剂而被关注。
[0006] 例如，已经证明人rIL-2在25-30%的转移性黑色素瘤或肾癌患者中导致肿瘤消 退。间歇性IL-2疗法也与高活性抗逆转录病毒疗法联合用于HIV-感染患者中，该疗法恢 复CD4+T淋巴细胞的持续的保护水平。
[0007] 然而，由于具有剂量依赖毒性，这些细胞因子的使用是受限制的，这种限制特别 体现为以增加的血管通透性和降低的微循环灌注为特点的血管渗漏综合征（VLS)，从而在 IL-2施用的2-24h内导致间质水肿和多器官功能衰竭。
[0008] 细胞因子诱导的VLS的机制分析已经证明了在VLS的一些阶段中与细胞因子 诱导的NK细胞关联（ASSIER等·Cytokines,vol. 32 (6)，p: 280-6, 2005)。由于Treg细 胞的耗竭加剧VLS，从而建立了T细胞的VLS关联（Κ0ΤΤΚΕ等.Mol.Ther.，vol. 16 (7) ，p:1217-26, 2008)。
[0009] 最后，细胞因子的应用实际上局限于一个最大NK细胞增殖诱导，从而不会诱导不 可接受或致命的VLS。
[0010] 由于上述需求和安全问题，高剂量的细胞因子的应用实际上局限于慢性感染和晚 期转移性癌症。
【发明内容】
[0011] 现在，发明人已经惊奇的证实，与IL-15或IL-12任一个相比，他们的包含hIL-15 氨基酸序列的分子（RLI)显示了非常不同的安全性，其中RLI的安全性更有利。最后，他们 的研究结果表明RLI可用于对IL-2和IL-15而言是无法想象的治疗窗。
[0012] 这种安全性使得高剂量RLI在治疗与不良预后相关的疾病中的应用和最低剂量 RLI在治疗与正确或良好预后相关的疾病中的应用成为可能。
[0013] 因此，第一方面，本发明涉及一种通过向受试者施用一定量的缀合物从而诱导天 然杀伤细胞（NK细胞）增殖来治疗所述受试者的癌症、感染或免疫缺陷障碍的组合物，所述 增殖与采用高剂量的白细胞介素-2(HDIL_2)得到的增殖相比相同或者更高，其中所述缀 合物包含：
[0014]a)包含白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和
[0015]b)包含IL_15Rasushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽。
[0016] 第二方面，本发明涉及一种用于治疗受试者的癌症、感染或免疫缺陷障碍的方法， 所述方法包括向有此需要的受试者施用一定量的缀合物从而诱导天然杀伤细胞（NK细胞） 增殖的步骤，所述增殖与采用HDIL-2得到的增殖相比相同或者更高，其中所述缀合物包 含：
[0017]a)包含白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽，和
[0018]b)包含IL_15Rasushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽。
[0019] 优选地，所述缀合物还以诱导⑶8T细胞增殖的量施用，所述增殖比采用HDIL-2 得到的增殖高。 ^
[0020] 在第三优选的实施方案中，所述缀合物以诱导Treg细胞$〇逆3+004+0025? )增殖 的量施用于受试者，所述增殖比采用HDIL-2得到的增殖低。
[0021] 第三方面，本发明涉及一种用于确定要向患有癌症、感染或免疫缺陷障碍的受试 者施用的缀合物的治疗有效量的（体外）方法，所述方法包括以下步骤：
[0022] i)在使源自所述受试者的外周血单核细胞（PBMC)能够增殖的培养条件下，使所 述PBMC与量渐增的如上所定义的缀合物接触；
[0023]ii)在使源自所述受试者的其它PBMC能够增殖的培养条件下，使所述其它PBMC与 高剂量的白细胞介素-2(HDIL_2)接触；和
[0024]iv)筛选缀合物的治疗有效量，所述治疗有效量诱导所述PBMC的NK细胞增殖，所 述增殖与采用HDIL-2得到的增殖相比相同或者更高。
[0025] 进一步优选地，所述缀合物的量诱导的增殖NK细胞和/或CD8T细胞的百分数与 Treg细胞的百分数的比率比采用HDIL-2得到的比率高至少25%;优选地高至少50%;和 进一步优选地比采用HDIL-2得到的比率高至少75%。
【附图说明】
[0026] 图1示出与IL-2和IL-15相比，RLI对人外周血单核细胞（PBMC)的体外剂量-效 应。
[0027] 图2示出与IL-2和IL-15相比，RLI对人Treg亚群的体外效应。
[0028] 图3摘要叙述小家鼠（Musmusculus)注射的实验规程。
[0029] 图4示出注射了PBS、IL-2、IL-15或RLI的小鼠中增殖NK细胞、CD8+T细胞、 Foxp3+CD4+T细胞和Foxp3CD4+T细胞的比例。
[0030] 图5示出注射了PBS、IL-2、IL-15或RLI的小鼠中增殖NK细胞与Foxp3+T细胞 (Treg)的比率。
[0031] 图6示出NK细胞、⑶8+T细胞和⑶4+T细胞中FNy产生细胞的百分数，以及对于 注射了PBS、IL-2、IL-15或RLI的小鼠针对YAC-1细胞系的NK细胞的细胞毒性。
[0032] 图7示出在注射了供体细胞和PBS、IL-2、IL-15或RLI的小鼠中供体细胞、MP ⑶8+T细胞和NK细胞的总细胞数。
[0033] 图8示出注射了供体细胞和PBS、IL-2、IL-15或RLI的小鼠中的VLS。
[0034] 图9示出取决于细胞因子治疗方案的肿瘤体积的演变。
[0035] 图10示出取决于随着时间变化的注射剂量，观察到的和模型化的猕猴血液中RLI 浓度的演变。
[0036] 图11示出在注射了PBS、IL-2、IL-15和RLI的小鼠中VLS相对于诱导的ΝΚ和CD8 细胞增殖。
[0037] 图12示出与PBS相比，等摩尔剂量的RLI、IL-2和IL-15对源自健康供体的PBMC 的NK细胞和CD8T细胞在第3、4、5、6和7天的体外增殖效应。
[0038] 图13示出RLI对NK细胞扩增的剂量-反应效应。
[0039] 图14示出RLI对肺和肝中的VLS的剂量-反应效应。
[0040] 图15示出RLI对肺中的VLS的剂量-反应效应。
[0041] 图16示出RLI对NK细胞扩增的剂量-反应效应。
[0042] 图17示出RLI对Treg细胞扩增的剂量-反应效应。
[0043] 图18示出RLI对Treg细胞与NK细胞百分数的比率的剂量-反应效应。
[0044] 图19示出RLI的药效相对于毒性。
【具体实施方式】
[0045] 本文所用术语"受试者"是指哺乳动物，例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物或灵长 类动物，且最优选的为人。
[0046] 术语"缀合物"为其在本领域中的一般含义，是指共价或非共价复合物，其中优选 的是指共价复合物，且最优选的是指融合蛋白。
[0047] 术语"白细胞介素2"采用其在本领域中的一般含义（其核酸及氨基酸序列分别参 见登录号ΝΜ_〇〇〇586· 3 和ΝΡ_000577· 2)。
[0048] 表述"高剂量的白细胞介素_2"或"HDIL-2"是本领域技术人员公知的。在美国， 高剂量的IL-2 (每8小时静脉注射600, 000 - 720, 000IU/kg)是最常用的治疗方案。例如， 美国食品药品监督管理局（FDA)批准的用于治疗转移性肾细胞癌或黑色素瘤（具有少于6 个月的中位生存期（medianprognosis)的癌症）的剂量为600, 000IU/kg，其施用是通过每 8小时最大14个剂量的静脉推注15分钟。接下来休息9天，若患者能够接受，则重复该治 疗方案。由于其可能降低毒性但危害功效，低剂量皮下IL-2治疗方案（1 - 30百万IU/m2/ d)已经被调查（FYFE,FISHER&R0SENBERG等，J.Clin.Oncol.，vol. 13,p:668-696, 1995)。 PROLEUK1N?的生物效价是通过淋巴细胞增殖生物测定确定的，且以由世界卫生组织 第一届国际标准为白细胞介素_2(人）建立的国际单位表示。效价与蛋白质质量之间的关 系如下：18百万国际单位的PR0LEUKIN= 1.lmg蛋白质。
[0049] 应当注意的是，在缺少替代疗法的情况下，对于能够增加患者生存期的致死疾病 (例如转移性肾细胞癌或黑色素瘤）的疗法，法律当局（如FDA、EMA等）会忍受更多的副 作用。
[0050] 术语"白细胞介素15"为其在本领域的一般含义，是指具有类似于IL-2的结构的 细胞因子（Grabstein等，Science,vol. 264 (5161)，p: 965-968, 1994)。这种细胞因子也被 称为IL-15、IL15或MGC9721。这种细胞因子和IL-2共享许多生物活性，且发现它们结合 相同的促红细胞生成素受体亚基。因此，IL-15和IL-12可以竞争相同的受体，从而负调节 彼此的活性。已经证实，IL-15调节T细胞和自然杀伤细胞的活化和增殖，且证明⑶8+记 忆细胞的数量由IL-15这种细胞因子和IL-2之间的平衡来控制。如实施例中所公开的， IL-15的活性可以通过测定其对kit225细胞系的增殖诱导来测定（HORI等，Blood，vol. 70 ( 4),p:1069-72, 1987)〇
[0051] 对于kit225细胞系的增殖诱导，所述IL-15或其衍生物具有人白细胞介素-15的 活性的至少10 %，优选地至少25 %和更优选地至少50 %。
[0052] 所述白细胞介素15为哺乳动物白细胞介素15,优选地为灵长类动物白细胞介素 15,和更优选地为人白细胞介素15。
[0053] 本领域技术人员可以简单地识别哺乳动物白细胞介素15。作为实例，可以引 用源自野猪（Susscrofa)(登录号：ABF82250)、褐家鼠（Rattusnorvegicus)(登录 号：NP_037261)、小家鼠（Musmusculus)(登录号：NP_032383)、牛（BosTaurus)(登录 号：NP_776515)、家兔（Oryctolaguscuniculus)(登录号：NP_001075685)、绵羊（Ovies aries)(登录号：NP_001009734)、家猫（Feliscatus)(登录号：NP_001009207)、食蟹猴 (Macacafascicularis)(登录号：BAA19149)、智人（登录号：NP_000576)、恒河猴（Macaca Mulatta)(登录号：NP_001038196)、土拨鼠（Caviaporcellus)(登录号：NP_001166300)或 绿猴（Chlorocebussabaeus)(登录号：ACI289)的白细胞介素15。
[0054] 本文所用术语"哺乳动物白细胞介素15"是指共有序列SEQIDNO: 1。
[0055] 本领域技术人员可以简单地识别灵长类动物白细胞介素15。作为实例，可以 引用源自野猪（登录号：ABF82250)、家兔（登录号：NP_001075685)、食蟹猴（登录号： BAA19149)、智人（登录号：NP_000576)、恒河猴（登录号：NP_001038196)或绿猴（登录号： ACI289)的白细胞介素15。
[0056] 本文所用术语"灵长类动物白细胞介素15"是指共有序列SEQID N0:2。
[0057] 本领域技术人员可以简单地识别人白细胞介素15,且所述人白细胞介素15是指 氨基酸序列SEQIDN0:3。
[0058] 本文所用术语"白细胞介素15的衍生物"是指与选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2 和SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少92. 5% (即对应于约10个氨基酸置换）、优选地至 少96% (即对应于约5个氨基酸置换）、和更优选地至少98. 5% (即对应于约2个氨基酸 置换）或至少99% (即对应于约1个氨基酸置换）同一性百分数的氨基酸序列。本领域技 术人员根据其自身的知识及本专利申请的教导可以简单地识别这类衍生物。作为这类衍生 物的实例，可以引用国际专利申请PCTW0 2009/135031中描述的那些。还应当理解的是天 然的氨基酸可以被化学修饰的氨基酸替换。通常，这种化学修饰的氨基酸增加多肽的半衰 期。
[0059] 本文所用术语两个氨基酸序列之间的"同一性百分数"是指通过两个序列的最 佳比对获得的将进行比较的所述两个序列之间相同氨基酸的百分数，这一百分数是纯粹 统计学意义的且两个序列之间的差异被随机地分布于氨基酸序列中。本文所用"最佳比 对"或"最优比对"是指所确定的同一性百分数（参见下文）最高的比对。两个氨基酸 序列之间的序列比较通常是通过比