0131] 另一方面，本发明的植入物（即其上沉积有细胞的基质）不必受基质的尺寸限制。 如果需要厚度大于1. 〇mm的植入物，例如出于稳定性原因或为了为细胞提供更大的附着位 点，则可以用彼此上下铺叠且可选地胶接或缝合在一起的至少两个基质来制备该植入物。 优选地，这种"双层或多层植入物"由在组装前已加载有细胞的至少两个基质来制备。
[0132] 根据特别优选的实施方式，将本发明的植入物制备成形成整体稳定主体的双层或 多层结构，其制备通过以下程序进行：
[0133] a)提供本发明的基质，该基质基本为片形且厚度为约0· 1mm至1. 0mm;
[0134] b)将细胞一一特别是肝细胞和至少一种胰岛细胞加载于所述基质的至少一侧 上；
[0135] c)将其上具有细胞的基质折叠为多层结构。
[0136] 在步骤c)中折叠基质之前，优选将基质置于提供最佳细胞增殖条件的温育器中。 上文限定的基质的优选厚度确保了能通过扩散为细胞提供充分的氧气和养料，从而使其能 增殖并形成功能性组织（例如转运通道），还能够激活整个基质结构体中的物质转运。当随 后将基质折叠为多层结构（步骤c)时，物质运送也能通过遍及基质新形成的功能组织而活 跃地发生。另外，由于基质优选被折叠而不是由几个个体基质组装，因而所得到的植入物特 别稳定，并且允许便利的运送和植入，而没有解体风险。
[0137] 最优选地，在步骤b)中，细胞被加载于基质的两侧上，即上侧和下侧上。这使得能 够从上部和下部迀移至基质内。细胞在基质两侧上的加载可以通过以下方式实现：将细胞 加载至基质的第一侧，然后翻转基质以便将细胞加载至基质的另一侧。该程序可以反复数 次，期间将基质短时间温育，以使细胞迀移进入基质，而后将更多细胞加载至基质表面上。
[0138] 特别优选的是提供总厚度为1mm至10mm的多层植入物。例如，优选将厚度为0. 6_ 的基质折叠两次来得到总厚度（或高度）为1. 8_的三层植入物。
[0139] 此外还可以用多于一种基质制备多层植入物。例如，可以将较小基质置于第二种 更大基质的中心，随后将第二基质的边缘折叠以包围内部的较小基质。换言之，可以用"包 裹"第一基质的第二基质来将较小的第一基质包封。如此，可以用第一细胞类型接种第一基 质，用第二细胞类型接种第二基质，然后折叠第二基质包围第一基质。
[0140] 本发明特别涉及治疗会导致慢性肝病或胰腺病和/或慢性肝衰竭和胰腺衰竭的 疾病。这些疾病包括例如成年人的慢性肝炎和胆汁性肝硬化以及儿童的胆道闭锁和先天性 代谢缺陷。事实上，本发明的基质可以在所有表示需要肝脏移植的情形和所有肝损伤或功 能不全的情形中用来缓解疾病。另一方面，特别是在所有形式的糖尿病、特别是I型或II型糖尿病的情形中，需要胰腺移植。对于治疗胰腺疾病或胰腺衰竭，优选对植入物提供肝细 胞和胰岛细胞，最优选其比例为约1个肝细胞比约100个胰岛细胞。
[0141] 因此，本发明还涉及本发明的基质或本发明的植入物在制备用于对个体进行移植 的治疗剂中的应用，而且在此方面所述治疗剂特别用于治疗罹患将被移植物所替代的功能 性组织的至少部分丧失的个体。
[0142] 鉴于所述基质在肝移植学领域的优选应用，本发明还提供了用于制备肝植入物的 试剂盒。所述试剂盒包含：
[0143] i)至少一种本发明的基质，和
[0144] ii)多细胞微组织球状体，其包含培养基中的预组装细胞簇。
[0145] 根据特别优选的实施方式，所述试剂盒包含至少一种本发明的基质和在培养基中 的至少一种胰岛细胞和肝细胞的预组装细胞簇。
[0146] 所述多细胞微组织球状体优选根据上文所述的"悬滴技术"制备，例如根据由 InSpheroAGSwitzerland的专利GravityPLUS?悬滴技术来制备。
[0147] 在不以下文的应用限制本发明的条件下，本发明的基质可以用于例如成纤维细 胞、肌肉细胞或粘膜细胞的移植。粘膜细胞移植在涉及小肠的手术程序中特别受关注。
[0148] 将在实施例中更详细地对本发明的基质的制备方法进行描述。以下实施例是说明 性的，并不限制本发明的范围。在不脱离本发明的范围的前提下可以进行合理变化，例如本 领域技术人员所合理想到的。
[0149] 材料和方法
[0150] 基质制备
[0151] 通过以下程序制备直径20mm且厚2mm的基质：
[0152] 实施例1
[0153] 利用过筛的氯化钠微粒通过微粒浸出技术从PGLA制备三维一级结构。
[0154] 分子量为90kD至126kD的聚（DL-乳酸-co-乙醇酸）（PLGA75:25)购自Evonik IndustriesAG(Essen,德国）。将PGLA颗粒冷冻在液氮（N2)中并以lOOOOrpm粉碎2分 钟（DSsditer#击系统）。粉碎过程在球磨机中进行并在研磨后过筛。如此获得的颗粒的 平均直径为108μm至250μm。
[0155] 将2g聚合物团粒于22. 5°C在50ml氯仿中溶解80分钟，产生聚合物溶液（A)。
[0156] 在下一步中，将纯NaCl以lOOOOrpm粉碎2分钟。如此获得的颗粒的平均直径为 108μm至 390μm。
[0157] 将0. 5g经粉碎的聚合物团粒与48g经粉碎的NaCl颗粒以90rpm混合4分钟，以聚 合物溶液（A)填装并安置在圆形陶瓷小盘中。将溶剂在35°C蒸发28小时。在控温烘箱中 进行溶剂蒸发，烘箱被安置在通风橱中以抽取氯仿有毒气体。将剩余盐/聚合物复合体在 高压成型压缩机中于lOOOpsi加压1分钟，然后通过用去离子水洗涤所述复合体来将NaCl 浸出，直到干燥的一级结构的重量保持不变。将如此形成的具有一级孔的三维一级结构产 品在40°C干燥12小时。SEM分析表明一级结构具有均匀分布且互通的孔结构。孔径和形 态与所用NaCl微粒相同。然后在真空下将一级结构浸入I型胶原蛋白酸性溶液（1. 0(w/ v) %，pH3. 2,购自ICNBiomedicals,CostaMesa,California)中，使得一级孔填充有胶原 蛋白溶液。随后将含胶原蛋白溶液的一级结构在_80°C冷冻12小时并在0. 2托的真空下再 冻干24小时，以便在一级孔中形成二级胶原蛋白结构。通过在37°C用以25%戊二醛水溶 液饱和的戊二醛蒸气进行4小时的处理来使胶原蛋白结构进一步交联。在交联后，用0. 1M 甘氨酸水溶液处理基质以封闭未反应的醛基。在用去离子水洗涤并冻干后，获得了包含具 有一级孔的一级结构和包含在一级孔内的具有二级孔的三维二级胶原蛋白结构的基质作 为最终产物。
[0158] 实施例2
[0159] 将直径为355μπι至425μπι的经筛分的NaCl微粒（36. 0g)置于铝盘中并以浓度 为27 (w/v) %的PLGA的氯仿溶液（17. 8ml)填装。因此，PLGA溶解在氯仿中，然后浇铸在盛 有作为成孔剂（porogen)的NaCl微粒的错盘上。
[0160] 将混合物在空气流中风干48h，然后真空干燥48h。然后将干燥的PLGA/NaCl块体 从铝盘取出并浸泡在去离子水中以浸出NaCl微粒。继续进行20次洗涤，每次用500mL去 离子水洗涤lh，以将NaCl微粒完全去除。最后，在风干后形成PLGA-级结构。通过萊注入 孔率计（AutoPoreIV，Shimadzu，Kyoto,日本）来测定PLGA海绵的孔隙度。将PLGA-级 结构切割为6. 0mmX6. 0mmX5. 0mm的小块以进行表面处理。
[0161] 用盐酸水溶液（0. 001M)将1. 0(w/v)%的胶原蛋白水溶液稀释至胶原蛋白浓度为 0.5 (w/v)%，由此制备0.5 (w/v)%胶原蛋白水溶液（猪I型胶原蛋白，通过酶处理分离）。 将该0.5 (w/v)%胶原蛋白水溶液的pH设为2. 5至3. 5。
[0162] 在减压下将经切割的PLGA-级结构浸入0.5 (w/v) %胶原蛋白水溶液，以使一级 结构的一级孔填充有胶原蛋白溶液。将含有胶原蛋白溶液的PLGA-级结构置于细胞滤网 膜（其安置在50mL离心管中）上，并利用在4°C工作的多用低温型离心机LX-120(Tomy SeikoCo·,Tokyo,日本）或高速低温型离心机（HimacCR21G,Hitachi,Tokyo,日本）以 不同的离心加速度（968、60(^、120(^、240(^、500(^和10,00(^)离心10分钟，以便除去任 何过量的胶原蛋白溶液。离心后，将经胶原蛋白处理的PLGA结构体在-80°C的冷冻器中冷 冻4h。冷冻的多孔支架在低于25Pa的真空下冷冻干燥24h。冷冻干燥后，将涂布有胶原蛋 白的PLGA结构体在干燥器中储存待用。
[0163] 基质性质分析
[0164] 孔隙度计筧
[0165] 基质的孔隙度由下式确定：
[0166]
[0167] 三批生产工艺基质的孔隙度在表1中给出。
[0168] 表 1
[0169]
[0170] 胶原蛋白含量分析
[0171] 使用分析天平（AG135^6?16广1'〇16(1〇,0!1)，在将？11^一级结构浸入胶原蛋白 水溶液之前对其称重，并在离心后称量经胶原蛋白处理的PLGA结构体的湿重。两个重量之 差指示了在离心分离后保留在PLGA海绵中的胶原蛋白水溶液的量。
[0172] 亲水件分析
[0173] 亲水性如下测试：将300μ1磷酸盐缓冲盐水（PBS;Sigma)以逐滴方式移取至基 质顶部，以便确定该液体是被基质吸收还是排斥。
[0174] 细朐粘附测试
[0175] 通过用1型胶原蛋白涂布基质并以逐滴方式将300μ1细胞悬浮液移取至基质顶 部来测试基质上的细胞粘附性。其后，将加载有细胞悬浮液的基质在37°C、5% 0)2和95% 的相对湿度下温育。在更换培养基的同时，于1至3天后对保留在悬浮液中且因此未附着 至基质的细胞进行计数。
[0176] 细朐数计筧
[0177] 在用0. 2 %台盼蓝溶液将细胞悬浮液染色2分钟后，用血细胞计数器（Neubauer ImprovedChamber)测定细胞数。
[0178] 附着的细胞的数目根据下式来确定：
[0179] [接种至基质上的细胞数]-[保留在板孔中的细胞数]=粘附至基质上的细胞数
[0180] 细胞分离
[0181] 缩写和物质：
[0182] -EGTA:乙二醇四乙酸（SigmaE4378)
[0183] -I型胶原蛋白酶：（Worthington4196 ;246U/mg)