一种板层角膜基质支架及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种板层角膜基质支架及其制备方法，该方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理，并在酶消化处理后进行超声处理，然后再进行干燥和灭菌处理。本发明还提供了所述板层角膜基质支架在作为角膜基质替代物中的应用。本发明的方法最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，板层结构保留完整，提高了支架材料的生物相容性。
【专利说明】一种板层角膜基质支架及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及角膜基质替代物领域，具体地，涉及一种板层角膜基质支架及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]角膜位于眼球最表面，直接与外界接触，容易受到损伤(物理、化学)和感染，一旦发生病变则会发生混浊而影响视力，甚至致盲。常见的角膜病变有角膜炎、角膜溃疡、圆锥角膜、角膜软化症和角膜变性等。据世界卫生组织(WHO)统计，目前全世界有角膜病盲患者近5000万人，我国有约400万人。角膜病严重影响了患者们的正常生活、工作与学习，生活上需要家人和社会的照顾，增加了家庭的经济负担，也加重了全社会的负担。角膜移植是角膜病盲患者恢复视力和复明的唯一希望，但由于我国角膜捐献数量极其有限，全国每年能进行的角膜移植手术目前仅有3000余例，致使绝大多数患者因得不到可用的供体角膜而无法重见光明。
[0003]目前，国内外同类产品主要以羊膜、胶原及其他合成高分子材料用于角膜移植研究，但都存在不同的缺陷。羊膜相对较薄，仅适用于治疗眼表浅度损伤。合成材料的透明性和稳定性较差，在降解过程中降解产物可引起局部PH值下降，术区出现非特异性无菌性炎症反应率较高。胶原是组织工程常用的材料，但纯胶原韧性差，易碎，降解过快，手术后一段时间内就发生碎裂，无法达到复明的效果，因此目前仍停留在基础研究阶段。相比而言，异种角膜基质材料来源丰富，具有与正常角膜基质相似的组织结构，移植之后角膜基质的厚度、屈光度不变。天然的角膜基质层存在着某些生长因子，可促进细胞的生长、繁殖和分化，而且免疫原性低，神经 可以长入，有利于角膜知觉的恢复。此外，由于异种移植供体来源的动物，如猪，在生理上与人类具有高度相似性，故其组织或器官被认为是理想的供体之一，以猪作为异种移植供体来源的研究比较深入，猪的组织器官(如心脏瓣膜、胰岛细胞、凝血因子等)已用于人类疾病的治疗，异体脱细胞真皮基质已被批准用于临床。猪角膜基质含有角膜细胞生长所必需的I型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白等细胞外基质成分，具有良好的生物相容性，能够成为有效的角膜基质替代物。
[0004]异种移植供体来源的动物(如猪)的角膜基质组织中含有自身固有的细胞，需经过脱细胞处理才能获得无免疫原性或免疫原性较低的角膜基质替代物。现有的角膜基质替代物主要通过将动物源性角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理获得，且酶消化一般采用含有胰酶的缓冲液进行处理。这样的方法对制备得到的角膜基质替代物的胶原板层结构破坏较大，使得胶原纤维排列较凌乱，孔隙不均匀，且透光率较低，并不能完全满足临床移植的要求。
[0005]因此，研发一种能够完全脱除异种移植供体来源的动物(如猪)角膜基质中的细胞成分，对胶原板层结构破坏极小，使所得角膜基质的板层结构保留完整且胶原纤维排列整齐、孔隙均匀规则且透光率较高的角膜基质替代物的制备方法，具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了克服现有方法对制备得到的角膜基质替代物的胶原板层结构破坏较大，使得胶原纤维排列较凌乱，孔隙不均匀，且透光率较低，并不能完全满足临床移植要求的缺陷，提供一种胶原纤维排列整齐、孔隙均匀规则且透光率较高的板层角膜基质支架及其制备方法和应用。
[0007]本发明的发明人在研究中意外发现，在制备板层角膜基质支架时，采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行酶消化处理，并在酶消化处理之后干燥处理之前进行超声处理，不仅能够完全脱除角膜基质中的细胞成分，而且能够最大程度地减少对角膜基质胶原板层结构的破坏，使所得角膜基质的板层结构保留完整且胶原纤维排列整齐、孔隙均匀规则、透光率高，与人角膜基质细胞具有理想的生物相容性，能够最大程度地满足移植要求。
[0008]因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种板层角膜基质支架的制备方法，将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理，并在酶消化处理后进行超声处理，然后再进行干燥和灭菌处理。
[0009]第二方面，本发明提供了所述方法制备得到的板层角膜基质支架。
[0010]第三方面，本发明还提供了所述板层角膜基质支架在作为角膜基质替代物中的应用。 [0011]本发明的板层角膜基质支架，来源丰富，生物相容性及生物安全性好，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整；理化性能良好，角膜透光率为70% -80% ;机械强度高，能够耐受手术缝线牵拉、韧性良好并能长期应用于临床，主要用于治疗角膜外伤、角膜溃疡、混浊、疤痕、化学或热烧伤等致盲性眼病，将病变处被损坏的角膜切除并将同样尺寸的板层角膜基质支架植入患者眼中，能够达到构建健康角膜组织、改善患者视力的效果。
[0012]本发明方法中，为了最大程度地使支架材料满足移植要求，对各步骤的条件包括时间、温度、酶种类选择及酶浓度、超声频率及超声时间等进行了详细周密的设计和严格反复的验证。通过一系列实验的优化，使本发明的方法具有以下特点:
[0013]I)本发明方法的工艺流程简单可靠，周期短。
[0014]2)本发明方法采用的原料来源广泛，成本低，使用方便。
[0015]3)本发明的方法，最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，胶原纤维排列整齐，无细胞残留，前弹力层及基底膜都保留，便于上皮层的生长，提高了支架材料的生物相容性。
[0016]4)本发明方法制备得到的板层角膜基质支架，通过自检、型式检验验证了该产品的安全性，结果显示其机械性能、理化性能及生物学性能都满足临床移植的要求。
[0017]5)本发明方法制备得到的板层角膜基质支架，适合用于基质层异常角膜的临床移植，使众多角膜基质异常患者重见光明成为可能，为组织工程角膜产业提供了重要的技术支持。
[0018]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明实施例1制备得到的板层角膜基质支架的冰冻切片图。
[0020]图2是正常人角膜板层结构的冰冻切片图。
[0021]图3是本发明对比例I制备得到的板层角膜基质支架的冰冻切片图。
[0022]图4是本发明对比例2制备得到的板层角膜基质支架的冰冻切片图。
【具体实施方式】
[0023]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0024]第一方面，本发明提供了一种板层角膜基质支架的制备方法，将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理，其中，酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理，并在酶消化处理后进行超声处理，然后再进行干燥和灭菌处理。
[0025]根据本发明的方法，本领域技术人员可以理解的是，在无菌条件下切取角膜基质片前，一般先将新鲜动物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡。PBS缓冲液可以为I XPBS缓冲液。
[0026]对于酒精和妥布霉素的浓度以及浸泡时间没有特别的要求，可以为本领域常用的浓度和浸泡时间。优选情况下，酒精的体积百分浓度为70-80%，进一步优选为75% ;妥布霉素的浓度为30000-50000U/L，进一步优选为40000U/L ;浸泡时间为10_30s。
[0027]对于切取的角膜基质片的直径和厚度没有特别的要求，可以为本领域常规的角膜基质片的直径和厚度。优选情况下，切取的角膜基质片的直径为8-10mm，厚度为200-600 μ mD
[0028]为了提高制得的板层角膜基质支架和人角膜基质细胞的生物相容性，优选情况下，动物为猪、牛或猴，进一步优选为猪。
[0029]根据本发明的方法，低渗溶胀处理的方法可以包括:将切取的角膜基质片放在低渗液中浸泡至溶胀。对于低渗液没有特别的要求，可以为本领域常用的各种低渗液，为了能够更好地胀破细胞膜和核膜，优选情况下，低渗液为三蒸水。为了使角膜基质片在低渗液中溶胀至合适的程度，优选情况下，浸泡的时间为8-12h。
[0030]根据本发明的方法，为了最大程度地减少对角膜基质胶原结构的破坏，更好地骤缩骤胀细胞膜和核膜，进而使细胞膜和核膜破损，优选情况下，反复冻融的条件包括:冷冻时间为30-60min，冷冻温度为-200~_50°C，融化时间为15_30min，融化温度为30_40°C，循环次数为2-5次。
[0031]根据本发明的方法，为了更充分地破坏核酸，完全脱除细胞，完整保留板层结构，且使得胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，使制得的板层角膜基质支架与人角膜基质细胞具有更好的生物相容性，优选情况下，酶消化处理的条件包括=DNA酶与缓冲液的体积比为1:500-1500，RNA酶与缓冲液的体积比为1:1500-2500，温度为30_40°C，时间为2_4h。对于缓冲液的种类没有特别的要求，可以为本领域常用的用于DNA酶和RNA酶的缓冲液，例如可以为Tris-Hcl缓冲液、Hanks缓冲液或IXPBS缓冲液。
[0032]根据本发明的方法，为了使胶原纤维束更好地形成网络结构，使胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，优选情况下，超声处理的条件包括:温度为20-40°C，超声功率为200-500W,超声时间为2-5h。超声采用的超声仪可以为本领域常用的各种超声仪，只要能够控制超声仪的参数，使得温度为20-40°C，超声功率为200-500W，超声时间为2_5h即可。
[0033]根据本发明的方法，本领域技术人员应该理解的是，该方法还可以包括:在酶消化处理之后超声处理之前、超声处理之后干燥处理之前将角膜基质片进行清洗。对于清洗的条件没有特别的要求，可以为本领域常规的清洗条件。优选情况下，在摇床上用无菌三蒸水清洗3-5次，摇床的转速为100-200rpm，每次清洗的时间为5_15min。
[0034]根据本发明的方法，对于干燥处理的条件没有特别的要求，可以为本领域常用的各种条件。为了进一步提高制得的板层角膜基质支架的生物相容性，优选情况下，干燥处理的条件包括:在无菌条件下，用20-37°C的空气吹干或在20-37°C下烘干，干燥时间为2_5d。
[0035]对于灭菌的条件没有特别的要求，可以为本领域常用的各种灭菌条件。为了更好地去除制得的板层角膜基质支架的抗原性，优选情况下，灭菌的条件包括:采用钴-60或电子束辐照灭菌，辐照剂量为20-30kGy。
[0036]根据本发明的方法，该方法还可以包括将灭菌后的板层角膜基质支架进行复水处理。对于复水处理的条件没有特别的要求，可以为本领域常用的各种条件。优选情况下，复水剂为生理盐水、I XP BS溶液或DMEM培养液，复水时间为12_24h。
[0037]本发明还提供了上述方法制备得到的板层角膜基质支架。
[0038]本发明的板层角膜基质支架为动物源性脱细胞板层角膜基质片，不含细胞成分，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，透光率为70% -80%。
[0039]根据本发明的方法可知，本发明的板层角膜基质支架可以以干燥的板层角膜基质支架和复水的板层角膜基质支架这两种形式存在。复水的板层角膜基质支架是以干燥的板层角膜基质支架为基础，经过复水处理得到的板层角膜基质支架。
[0040]本发明还提供了板层角膜基质支架在作为角膜基质替代物中的应用。
[0041]本发明的板层角膜基质支架可用于治疗角膜外伤、角膜溃疡、混浊、疤痕、化学或热烧伤等角膜病变。
[0042]实施例
[0043]以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
[0044]以下实施例和对比例中，将用生理盐水充分浸泡的角膜基质支架材料，平整紧密地贴在比色皿内壁，加生理盐水，以不贴角膜基质支架材料的比色皿加生理盐水作为对照，采用紫外-可见光分光光度计(型号:UV-5300型，上海元析仪器有限公司)测定角膜基质支架材料在不同波长下(400nm、500nm、600nm、700nm、800nm)的透光率,然后计算平均值。
[0045]冰冻切片的方法为:将用生理盐水复水的板层角膜基质支架材料浸润在OCT包埋剂中，在_80°C的环境中速冻30min，然后固定在样品托上，修片，用冰冻切片机(型号:Thermo Cryotome FE型,美国赛默飞世尔科技公司)切片(厚度为10 μ m),烤片2h,采用H.E染色法进行染色后，用光学显微镜(型号:CKX-41SF，日本奥林巴斯公司)进行观察。
[0046]实施例1
[0047]本实施例用于说明本发明的板层角膜基质支架及其制备方法。
[0048](I)取猪眼球，并将新鲜的猪眼球用体积百分浓度为75%的酒精浸泡20s，在超净台内，用角膜刀直接切取直径为9mm，厚度为400 μ m的角膜基质片；[0049](2)将切取的角膜基质片放在三蒸水中浸泡IOh ；
[0050](3)将步骤(2)得到的低渗溶胀的角膜基质片放在无菌的冻存管内，反复冻融，冷冻时间为40min，冷冻温度为_80°C，融化时间为20min，融化温度为37°C，循环次数为3次；
[0051](4)将经反复冻融的角膜基质片放在含有DNA酶和RNA酶的Tris-Hcl缓冲液中进行酶消化处理，DNA酶与Tris-Hcl缓冲液的体积比为1:1000，RNA酶与Tris-Hcl缓冲液的体积比为1:2000，在37 °C的恒温箱中处理3h ；
[0052](5)将经过酶消化处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗3次，摇床的转速为150rpm，每次清洗的时间为IOmin ;然后将角膜基质片置于超声仪中，进行超声处理，超声仪参数设定分别为:温度为30°C，超声功率为300W，超声时间为3h ；
[0053](6)将经超声处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗3次，摇床的转速为150rpm，每次清洗的时间为IOmin ;然后将角膜基质片置于平皿中在超净台内进行吹干处理，吹干时间为3d，即得到干燥的板层角膜基质支架，然后采用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，保存备用；
[0054](7)将灭菌后的干燥的板层角膜基质支架用生理盐水复水24h，即得到可移植的复水的板层角膜基质支架。
[0055]本实施例制得的板层角膜基质支架的透光率为80%。
[0056]本实施例制得的板层角膜基质支架(已脱细胞，放大倍数为40倍)的冰冻切片图见图1，正常人角膜板 层结构(未脱细胞，放大倍数为40倍)的冰冻切片图见图2。将图1和图2比较可知，本实施例制得的板层角膜基质支架具有与人角膜基质细胞相同的结构，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整。
[0057]实施例2
[0058]本实施例用于说明本发明的板层角膜基质支架及其制备方法。
[0059](I)取牛眼球，并将新鲜的牛眼球用含妥布霉素的I XPBS溶液(妥布霉素的浓度为40000U/L)浸泡30s，在超净台内，用角膜刀直接切取直径为8mm，厚度为200 μ m的角膜基质片;
[0060](2)将切取的角膜基质片放置于三蒸水中浸泡8h ；
[0061](3)将步骤(2)得到的低渗溶胀的角膜基质片放在无菌的冻存管内，反复冻融，冷冻时间为30min，冷冻温度为-200°C，融化时间为30min，融化温度为40°C，循环次数为2次；
[0062](4)将经反复冻融的角膜基质片放在含有DNA酶和RNA酶的I XPBS缓冲液中进行酶消化处理，DNA酶与I X PBS缓冲液的体积比为1:1500，RNA酶与I X PBS缓冲液的体积比为1:2500，在30 0C的恒温箱中处理4h ；
[0063](5)将经过酶消化处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗4次，摇床的转速为IOOrpm，每次清洗的时间为15min ;然后将角膜基质片置于超声仪中，进行超声处理，超声仪参数设定分别为:温度为20°C，超声功率为500W，超声时间为2h ；
[0064](6)将经超声处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗4次，摇床的转速为IOOrpm，每次清洗的时间为15min ;然后将角膜基质片置于平皿中在超净台内进行吹干处理，吹干时间为5d，即得到干燥的板层角膜基质支架，然后采用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为20kGy，保存备用；[0065](7)将灭菌后的干燥的板层角膜基质支架用IXPBS溶液复水12h，即得到可移植的复水的板层角膜基质支架。
[0066]本实施例制得的板层角膜基质支架的透光率为70%。
[0067]本实施例制得的板层角膜基质支架的冰冻切片图同图1，即，本实施例制得的板层角膜基质支架具有与人角膜基质细胞相同的结构，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整。
[0068]实施例3
[0069]本实施例用于说明本发明的板层角膜基质支架及其制备方法。
[0070](I)取猴眼球，并将新鲜的猴眼球用体积百分浓度为80%的酒精浸泡10s，在超净台内，用角膜刀直接切取直径为10mm，厚度为600 μ m的角膜基质片；
[0071](2)将切取的角膜基质片放置于三蒸水中浸泡12h ；
[0072](3)将步骤(2)得到的低渗溶胀的角膜基质片放在无菌的冻存管内，反复冻融，冷冻时间为60min，冷冻温度为_50°C，融化时间为15min，融化温度为30°C，循环次数为5次；
[0073](4)将经反复冻融的角膜基质片放在含有DNA酶和RNA酶的Hanks缓冲液中进行酶消化处理，DNA酶与Hanks 缓冲液的体积比为1:500，RNA酶与Hanks缓冲液的体积比为1:1500，在40°C的恒温箱中处理2h ；
[0074](5)将经过酶消化处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗5次，摇床的转速为200rpm，每次清洗的时间为5min ;然后将角膜基质片置于超声仪中，进行超声处理，超声仪参数设定分别为:温度为40°C，超声功率为200W，超声时间为5h ；
[0075](6)将经超声处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗5次，摇床的转速为200rpm，每次清洗的时间为5min ;然后将角膜基质片置于平皿中在37°C烘箱内进行无菌烘干，烘干时间为2d，即得到干燥的板层角膜基质支架，然后采用电子束辐照灭菌，辐照剂量为30kGy，保存备用；
[0076](7)将灭菌后的干燥的板层角膜基质支架用DMEM培养液复水20h，
[0077]即得到可移植的复水的板层角膜基质支架。
[0078]本实施例制得的板层角膜基质支架的透光率为75%。
[0079]本实施例制得的板层角膜基质支架的冰冻切片图同图1，即，本实施例制得的板层角膜基质支架具有与人角膜基质细胞相同的结构，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整。
[0080]试验例
[0081]对本发明实施例1-3制得的板层角膜基质支架进行生物学性能及生物安全性研究，检测方法和结果见表1。
[0082]表1
[0083]
【权利要求】
1.一种板层角膜基质支架的制备方法，将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌处理，其特征在于，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理，并在酶消化处理后进行超声处理，然后再进行干燥和灭菌处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶消化处理的条件包括:DNA酶与缓冲液的体积比为1:500-1500, RNA酶与缓冲液的体积比为1:1500-2500，温度为30_40°C，时间为2—4h0
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述超声处理的条件包括:温度为20-40°C，超声功率为200-500W，超声时间为2-5h。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述在无菌条件下切取新鲜动物眼球的角膜基质片的方法包括:先将新鲜动物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡，再在无菌条件下切取角膜基质片；所述酒精的体积百分浓度优选为70-80%，所述妥布霉素的浓度优选为30000-50000U/L，所述浸泡时间优选为10_30s ;所述切取的角膜基质片的直径优选为8-10mm，厚度优选为200-600 μ m ;所述动物优选为猪、牛或猴，进一步优选为猪。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述低渗溶胀处理的方法包括:将切取的角膜基质片放在低渗液中浸泡至溶胀，所述低渗液为三蒸水，所述浸泡的时间为8-12h。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述反复冻融的条件包括:冷冻时间为30-60min，冷冻温度为-200~_50°C，融化时间为15_30min，融化温度为30_40°C，循环次数为2-5次。
7.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述干燥处理的条件包括:在无菌条件下，用20-37°C的空气吹干或在20-37°C下烘干，干燥时间为2_5d ;所述灭菌的条件包括:采用钴-60或电子束辐照灭菌，辐照剂量为20-30kGy。
8.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括将灭菌后的板层角膜基质支架进行复水处理。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述复水处理的条件包括:复水剂为生理盐水、IXPBS溶液或DMEM培养液，复水时间为12_24h。
10.权利要求1-9中任意一项所述的方法制备得到的板层角膜基质支架。
11.权利要求10所述的板层角膜基质支架在作为角膜基质替代物中的应用。
【文档编号】A61L27/36GK104001214SQ201410230365
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】李青, 王宝泉, 彭艳婷, 王红梅, 李海燕 申请人:青岛中皓生物工程有限公司