专利名称：去细胞异种角膜基质载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种去细胞异种角膜基质载体及其制备方法和应用。
背景技术：
据1991年WHO统计，世界上约有角膜病和眼外伤角膜致盲者1000万人，每年新增病例约150万到200万。在我国，共有约400万角膜病盲人。角膜移植术是角膜病致盲患者唯一的复明手段。由于角膜供体材料匮乏，目前，我国每年仅能做角膜移植手术的不足1%。 因此，如何获取适用的角膜移植材料成为眼科界亟待解决的问题。随着组织工程学的发展，人工生物角膜的研究已成为当今国内外眼科学研究的热点。从临床应用的角度，组织工程化角膜并不一定需要具有全部三层结构，有时仅需要板层或单纯的角膜上皮、基质或内皮组织。目前利用自身或同种异体角膜上皮干细胞重建眼表的相关研究相对较多，其成功构建的难点在于寻找合适的载体。关于干细胞载体，国内外研究最多的是羊膜，它存在完整的基底膜和细胞外基质， 具有良好的组织相容性、抗炎和抗新生血管的作用。但羊膜相对较薄，厚度仅20μπι 100 μ m,如长时间在羊膜表面培养细胞，细胞生长不均勻，易脱落，始终不能完全透明，还存在潜在的HIV感染等危险。这些都影响了以羊膜为载体进行干细胞移植的研究和临床应用。因此期望选择更为理想的载体代替羊膜。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种胶原排列整齐，与正常角膜组织相似，复水后透明性好的去细胞异种角膜基质载体。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种去细胞异种角膜基质载体， 其特征在于，该载体是经高渗溶液联合酶消化法去除上皮细胞及基质细胞后的动物板层角膜；该载体的制备方法包括以下步骤(1)动物眼球的摘取和保存摘取动物眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的动物眼球置于湿房中，4°C 8°C保存二4小时内进行板层角膜的剖切；(2)板层角膜的剖切用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1)中保存的动物眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径5mm 12mm的刻度环钻钻取150 μ m 400 μ m厚的板层角膜；(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞301、将步骤( 中所述板层角膜放入高渗溶液中，在温度为25°C 40°C条件下浸泡1天 3天；所述高渗溶液为质量浓度3% 20%的NaCl水溶液；302、将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于含胰酶的缓冲溶液中，在温度为 25 °C 40°C条件下浸泡1天 4天，所述含胰酶的缓冲溶液中胰酶的质量百分含量为 0. 05% 0. 35% ；或者将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于胰酶替代物中，在温度为25V 40°C条件下浸泡1天 4天；所述缓冲溶液为D-Hanks溶液，所述胰酶替代物为 TrypLE Express ；303、将302中浸泡后的板层角膜取出后用去离子水洗涤3次，得到去细胞异种角膜基质载体；(4)干燥处理将303中所述去细胞异种角膜基质载体置于无菌平皿中，然后一同放入装有干燥剂的干燥器中，密封，室温下干燥脱水1天 3天，所述干燥剂为无水氯化钙；(5)消毒处理将步骤(4)中干燥后的去细胞异种角膜基质载体置于无菌瓶中，密封，然后采用Co 60辐射进行消毒处理，辐射照射总剂量为25kGy ；(6)保存将步骤(5)中经消毒处理后的去细胞异种角膜基质载体在室温条件下常规保存，备用。上述的去细胞异种角膜基质载体，所述动物为猪、牛或鸵鸟。本发明还提供了上述去细胞异种角膜基质载体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)动物眼球的摘取和保存摘取动物眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的动物眼球置于湿房中，4°C 8°C保存二4小时内进行板层角膜的剖切；(2)板层角膜的剖切用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1)中保存的动物眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径5mm 12mm的刻度环钻钻取150 μ m 400 μ m厚的板层角膜；(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞301、将步骤( 中所述板层角膜放入高渗溶液中，在温度为25°C 40°C条件下浸泡1天 3天；所述高渗溶液为质量浓度3% 20%的NaCl水溶液；302、将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于含胰酶的缓冲溶液中，在温度为 25 °C 40°C条件下浸泡1天 4天，所述含胰酶的缓冲溶液中胰酶的质量百分含量为 0. 05% 0. 35% ；或者将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于胰酶替代物中，在温度为25°C 40°C条件下浸泡1天 4天；所述缓冲溶液为D-Hanks溶液，所述胰酶替代物为 TrypLE Express ；303、将302中浸泡后的板层角膜取出后用去离子水洗涤3次，得到去细胞异种角膜基质载体；(4)干燥处理将303中所述去细胞异种角膜基质载体置于无菌平皿中，然后一同放入装有干燥剂的干燥器中，密封，室温下干燥脱水1天 3天，所述干燥剂为无水氯化钙；(5)消毒处理将步骤(4)中干燥后的去细胞异种角膜基质载体置于无菌瓶中，密封，然后采用Co 60辐射进行消毒处理，辐射照射总剂量为25kGy ；(6)保存将步骤(5)中经消毒处理后的去细胞异种角膜基质载体在室温条件下常规保存，备用。上述的去细胞异种角膜基质载体的制备方法，步骤301中所述NaCl水溶液的质量浓度为8% 12%。本发明进一步提供了上述去细胞异种角膜基质载体作为角膜移植供体在角膜移植中的应用，以及作为人工生物角膜支架在全层或板层人工生物角膜构建中的应用。上述的去细胞异种角膜基质载体作为角膜移植供体在角膜移植中的应用，应用方法为对需进行角膜移植的受体进行麻醉，术眼常规消毒，铺巾，开睑器开睑，上下直肌固定缝线，将去细胞异种角膜基质载体用生理盐水复水20分钟，用环钻在受体角膜中央钻取， 然后用角膜板层刀分离板层，形成植床，将复水后的去细胞异种角膜基质载体置于植床，用 10-0尼龙线缝合，球结膜下注射庆大霉素40000U加地塞米松2. 5mg,涂氧氟沙星眼膏，然后用3-0缝线褥式缝合眼睑，角膜移植手术完成。上述的去细胞异种角膜基质载体作为人工生物角膜支架在全层或板层人工生物角膜构建中的应用，所述板层人工生物角膜的构建方法包括以下步骤(1)基底膜化处理将去细胞异种角膜基质载体放入含0. lg/L纤维连接蛋白的 Hanks溶液或含0. lg/L纤维连接蛋白的生理盐水中，并置于37°C培养箱中孵育lh，然后将孵育后的去细胞异种角膜基质载体取出，放入含0. lg/L层粘连蛋白的Hanks溶液或含 0. lg/L层粘连蛋白的生理盐水中，并置于37°C培养箱孵育lh，吸出液体，再将孵育后的去细胞异种角膜基质载体置于37°C培养箱内干燥lh，得到载体膜片，备用；(2)上皮细胞接种无菌条件下摘取兔眼球，用含200U/mL青霉素和200U/mL链霉素的生理盐水反复冲洗兔眼球，剪下角膜缘，切除角膜缘上残存的结膜和色素组织，去除角膜内皮及基质，然后将角膜缘切成lmmX2mm的组织块，置于培养瓶中并使组织块的上皮面朝上，向培养瓶中加入细胞培养液，置于37°C，50mL/L的(X)2培养箱培养，根据代谢情况， 3 4天换细胞培养液一次，当细胞密度达到80% 90%时，向培养瓶中加入含0. 02wt% EDTA和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化5min lOmin，用含10% 胎牛血清的DMEM培养液终止消化，在转速为2000rpm的条件下将培养瓶中的培养物离心两次，每次离心lOmin，弃去上清，加入含IOwt %胎牛血清的DMEM培养液，吹打制成细胞浓度为2X IO5个细胞/mL的悬液，接种悬液于铺有步骤(1)中所述载体膜片的培养皿中，所述载体膜片的上皮面朝上，向培养皿中加入细胞培养液，培养条件与所述组织块在培养瓶中的培养条件相同，于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录；所述细胞培养液为常规 DMEM/F12培养基1 1，另含200mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、4mmol/L 谷氨酰胺、1000U/L胰岛素、Syg/L表皮生长因子和0. 118mmol/L腺嘌呤；(3)板层人工生物角膜的形成当细胞生长7 后，将生长有细胞的载体膜片置于 Transwell培养板中进行培养，细胞培养液及培养条件均与步骤( 相同，培养时载体膜片的底面浸于细胞培养液中，上皮面暴露于气体中，形成气液交界面，培养7 10天形成复层，构建得到板层人工生物角膜。所述全层人工生物角膜的构建方法包括以下步骤(1)基底膜化处理将去细胞异种角膜基质载体放入含0. lg/L纤维连接蛋白的 Hanks溶液或含0. lg/L纤维连接蛋白的生理盐水中，并置于37°C培养箱中孵育lh，然后将孵育后的去细胞异种角膜基质载体取出，放入含0. lg/L层粘连蛋白的Hanks溶液或含 0. lg/L层粘连蛋白的生理盐水中，并置于37°C培养箱孵育lh，吸出液体，再将孵育后的去细胞异种角膜基质载体置于37°C培养箱内干燥lh，得到载体膜片，备用；(2)内皮细胞接种无菌条件下摘取兔眼球，自角膜缘内侧Imm剪下全层角膜组织，将全层角膜组织置于培养皿中，用含200U/mL青霉素和200U/mL链霉素的无菌生理盐水冲洗，撕下全层角膜组织的后弹力膜，然后将全层角膜组织的内皮面朝上放入培养皿中，向培养皿中加入含0. 02wt% EDTA和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化15min 30min，用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，在转速为2000rpm的条件下将培养皿中的培养物离心两次，每次离心lOmin，弃去上清，加入含IOwt^胎牛血清的DMEM 培养液，吹打制成细胞浓度为2X IO5个细胞/mL的悬液，接种悬液于铺有步骤(1)中所述载体膜片的培养皿中，所述载体膜片的内皮面朝上，向培养皿中加入含10wt%胎牛血清的 DMEM培养液，370C CO2孵箱中培养，于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录，培养 72h，将培养后的载体膜片翻转使内皮面朝下；(3)上皮细胞接种无菌条件下摘取兔眼球，用含200U/mL青霉素和200U/mL链霉素的生理盐水反复冲洗兔眼球，剪下角膜缘，切除角膜缘上残存的结膜和色素组织，去除角膜内皮及基质，然后将角膜缘切成lmmX2mm的组织块，置于培养瓶中并使组织块的上皮面朝上，向培养瓶中加入细胞培养液，置于37°C，50mL/L的(X)2培养箱培养，根据代谢情况， 3 4天换细胞培养液一次，当细胞密度达到80% 90%时，向培养瓶中加入含0. 02wt% EDTA和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化5min lOmin，用含10% 胎牛血清的DMEM培养液终止消化，在转速为2000rpm的条件下将培养瓶中的培养物离心两次，每次离心lOmin，弃去上清，加入含IOwt %胎牛血清的DMEM培养液，吹打制成细胞浓度为2X IO5个细胞/mL的悬液，接种悬液于步骤O)中翻转后的载体膜片上，加入细胞培养液，培养条件与所述组织块在培养瓶中的培养条件相同，于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录；所述细胞培养液为常规DMEM/F12培养基1 1，另含200mL/L胎牛血清、 100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、4mmo 1 /L谷氨酰胺、1000U/L胰岛素、5 μ g/L表皮生长因子和0. 118mmol/L腺嘌呤；(4)全层人工生物角膜的形成当细胞生长7 后，将生长有细胞的载体膜片置于 Transwell培养板中进行培养，细胞培养液及培养条件均与步骤( 相同，培养时载体膜片的底面浸于细胞培养液中，上皮面暴露于气体中，形成气液交界面，培养7 10天形成复层，构建得到全层人工生物角膜。本发明与现有技术相比具有以下优点1、本发明通过高渗溶液和胰酶/胰酶替代物的联合作用去除细胞得到无活性细胞存在的异种角膜基质胶原组织，极大的降低了抗原性。2、本发明采用干燥剂非接触法进行去细胞异种角膜基质载体的脱水干燥，干燥后的载体胶原排列整齐，与正常角膜组织相似，载体复水后透明性好。3、本发明优选鸵鸟角膜基质作为载体材料，鸵鸟角膜直径大(> 20mm)，透明性好，韧性强，抗拉力大，组织结构5层，厚度与人角膜一致，光镜和电镜显示鸵鸟角膜基质板层结构与人一致，屈光指数与人接近，是一个理想的人工生物角膜支架材料。4、对本发明的去细胞异种角膜基质载体进行细胞毒性试验、溶血试验、致敏试验和眼部刺激试验，结果均符合国家相关标准。5、本发明的去细胞异种角膜基质载体可作为角膜移植供体直接进行治疗性角膜移植，也可作为人工生物角膜支架进行全层或板层的人工生物角膜的构建。下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
图1为本发明实施例1去细胞处理前鸵鸟角膜苏木素-伊红(HE)染色照片。图2为本发明实施例1去细胞处理后鸵鸟板层角膜苏木素-伊红(HE)染色照片。图3为本发明实施例1去细胞处理前鸵鸟角膜透射电镜照片。图4为本发明实施例1去细胞处理后鸵鸟板层角膜透射电镜照片。图5为本发明实施例6兔板层角膜移植术后当日照片。图6为本发明实施例6兔板层角膜移植术后7天照片。图7为本发明实施例6兔板层角膜移植术后6个月照片。
具体实施例方式实施例1去细胞鸵鸟角膜基质载体的制备(1)动物眼球的摘取和保存在正规、合格的屠宰场取处死2小时内的健康鸵鸟眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的眼球置于湿房中，4°C 8°C保存二4小时内进行板层角膜的剖切；(2)板层角膜的剖切用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1)中保存的鸵鸟眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径8mm的刻度环钻钻取 300 μ m厚的板层角膜；(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞301、将步骤⑵中所述板层角膜放入高渗溶液(质量浓度为12%的NaCl水溶液) 中，在温度为37 °C条件下浸泡2天；302、将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于胰酶替代物(TrypLE)中，在温度为 37 °C条件下浸泡2天；303、将302中浸泡后的板层角膜取出后用去离子水洗涤3次，经组织切片及透射电镜证实已无完整细胞存在，得到去细胞鸵鸟角膜基质载体；(4)干燥处理将303中所述去细胞鸵鸟角膜基质载体置于无菌平皿中，然后一同放入装有无水氯化钙的干燥器中，密封，室温下干燥脱水2天；(5)消毒处理将步骤⑷中干燥后的去细胞鸵鸟角膜基质载体置于无菌瓶中，密封，然后采用Co 60辐射进行消毒处理，辐射照射总剂量为25kGy ；(6)保存将步骤(5)中经消毒处理后的去细胞鸵鸟角膜基质载体在室温条件下常规保存，备用。图1是本实施例去细胞处理前鸵鸟角膜苏木素-伊红(HE)染色照片，光镜下见角膜分为5层，依次为上皮细胞层，前弹力层，基质层，后弹力层和内皮细胞层。图2是本实施例去细胞处理后鸵鸟板层角膜苏木素-伊红(HE)染色照片，光镜下仅见排列规则的胶原纤维。图3是本实施例去细胞处理前鸵鸟角膜透射电镜照片，照片中可见角膜上存在上皮细胞，基质有核细胞等细胞成份。图4是本实施例去细胞处理后鸵鸟板层角膜透射电镜照片， 照片中可看出，经去细胞处理后的鸵鸟板层角膜无任何细胞存在，仅见排列规则的胶原纤维。本实施例通过高渗溶液和胰酶替代物的联合作用去除细胞得到无活性细胞存在的鸵鸟角膜基质胶原组织，极大的降低了抗原性，采用干燥剂非接触法进行去细胞鸵鸟角膜基质载体的脱水干燥，干燥后的载体胶原排列整齐，与正常角膜组织相似，载体复水后透明性好。实施例2去细胞猪角膜基质载体的制备(1)动物眼球的摘取和保存在正规、合格的屠宰场取处死2小时内的健康猪眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的眼球置于湿房中，4°C 8°C保存二4小时内进行板层角膜的剖切；(2)板层角膜的剖切用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1)中保存的猪眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径5mm的刻度环钻钻取150 μ m 厚的板层角膜；(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞301、将步骤O)中所述板层角膜放入高渗溶液(质量浓度为3%的NaCl水溶液) 中，在温度为25 °C条件下浸泡3天；302、将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于含胰酶0. 05wt%的D-Hanks溶液中，在温度为25 °C条件下浸泡4天；303、将302中浸泡后的板层角膜取出后用去离子水洗涤3次，经组织切片及透射电镜证实已无完整细胞存在，得到去细胞猪角膜基质载体；(4)干燥处理将303中所述去细胞猪角膜基质载体置于无菌平皿中，然后一同放入装有无水氯化钙的干燥器中，密封，室温下干燥脱水3天；(5)消毒处理将步骤中干燥后的去细胞猪角膜基质载体置于无菌瓶中，密封，然后采用Co 60辐射进行消毒处理，辐射照射总剂量为25kGy ；(6)保存将步骤(5)中经消毒处理后的去细胞猪角膜基质载体在室温条件下常规保存，备用。本实施例通过高渗溶液和胰酶的联合作用去除细胞得到无活性细胞存在的猪角膜基质胶原组织，极大的降低了抗原性，采用干燥剂非接触法进行去细胞猪角膜基质载体的脱水干燥，干燥后的载体胶原排列整齐，与正常角膜组织相似，载体复水后透明性好。实施例3去细胞牛角膜基质载体的制备(1)动物眼球的摘取和保存在正规、合格的屠宰场取处死2小时内的健康牛眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的眼球置于湿房中，4°C 8°C保存二4小时内进行板层角膜的剖切；(2)板层角膜的剖切用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1)中保存的牛眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径5mm的刻度环钻钻取150 μ m 厚的板层角膜；(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞301、将步骤⑵中所述板层角膜放入高渗溶液(质量浓度为20%的NaCl水溶液) 中，在温度为40°C条件下浸泡1天；302、将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于含胰酶0. 35wt%的D-Hanks溶液中，在温度为40°C条件下浸泡1天；303、将302中浸泡后的板层角膜取出后用去离子水洗涤3次，经组织切片及透射电镜证实已无完整细胞存在，得到去细胞牛角膜基质载体；(4)干燥处理将303中所述去细胞牛角膜基质载体置于无菌平皿中，然后一同放入装有无水氯化钙的干燥器中，密封，室温下干燥脱水1天；(5)消毒处理将步骤中干燥后的去细胞牛角膜基质载体置于无菌瓶中，密封，然后采用Co 60辐射进行消毒处理，辐射照射总剂量为25kGy ；(6)保存将步骤(5)中经消毒处理后的去细胞牛角膜基质载体在室温条件下常规保存，备用。本实施例通过高渗溶液和胰酶的联合作用去除细胞得到无活性细胞存在的牛角膜基质胶原组织，极大的降低了抗原性，采用干燥剂非接触法进行去细胞牛角膜基质载体的脱水干燥，干燥后的载体胶原排列整齐，与正常角膜组织相似，载体复水后透明性好。实施例4去细胞鸵鸟角膜基质载体的制备(1)动物眼球的摘取和保存在正规、合格的屠宰场取处死2小时内的健康鸵鸟眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的眼球置于湿房中，4°C 8°C保存二4小时内进行板层角膜的剖切；(2)板层角膜的剖切用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1)中保存的鸵鸟眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径8mm的刻度环钻钻取 300 μ m厚的板层角膜；(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞301、将步骤⑵中所述板层角膜放入高渗溶液(质量浓度为8%的NaCl水溶液) 中，在温度为37°C条件下浸泡2天；302、将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于含胰酶0. 25wt%的D-Hanks溶液中，在温度为30°C条件下浸泡3天；303、将302中浸泡后的板层角膜取出后用去离子水洗涤3次，经组织切片及透射电镜证实已无完整细胞存在，得到去细胞鸵鸟角膜基质载体；(4)干燥处理将303中所述去细胞鸵鸟角膜基质载体置于无菌平皿中，然后一同放入装有无水氯化钙的干燥器中，密封，室温下干燥脱水3天；(5)消毒处理将步骤⑷中干燥后的去细胞鸵鸟角膜基质载体置于无菌瓶中，密封，然后采用Co 60辐射进行消毒处理，辐射照射总剂量为25kGy ；(6)保存将步骤(5)中经消毒处理后的去细胞鸵鸟角膜基质载体在室温条件下常规保存，备用。本实施例通过高渗溶液和胰酶的联合作用去除细胞得到无活性细胞存在的鸵鸟角膜基质胶原组织，极大的降低了抗原性，采用干燥剂非接触法进行去细胞鸵鸟角膜基质载体的脱水干燥，干燥后的载体胶原排列整齐，与正常角膜组织相似，载体复水后透明性好。实施例5去细胞猪角膜基质载体的制备
(1)动物眼球的摘取和保存在正规、合格的屠宰场取处死2小时内的健康猪眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的眼球置于湿房中，4°C 8°C保存二4小时内进行板层角膜的剖切；(2)板层角膜的剖切用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1)中保存的猪眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径12mm的刻度环钻钻取 400 μ m厚的板层角膜；(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞301、将步骤⑵中所述板层角膜放入高渗溶液(质量浓度为10%的NaCl水溶液) 中，在温度为37 °C条件下浸泡3天；302、将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于胰酶替代物(TrypLE)中，在温度为 30°C条件下浸泡4天；303、将302中浸泡后的板层角膜取出后用去离子水洗涤3次，经组织切片及透射电镜证实已无完整细胞存在，得到去细胞猪角膜基质载体；(4)干燥处理将303中所述去细胞猪角膜基质载体置于无菌平皿中，然后一同放入装有无水氯化钙的干燥器中，密封，室温下干燥脱水2天；(5)消毒处理将步骤中干燥后的去细胞猪角膜基质载体置于无菌瓶中，密封，然后采用Co 60辐射进行消毒处理，辐射照射总剂量为25kGy ；(6)保存将步骤(5)中经消毒处理后的去细胞猪角膜基质载体在室温条件下常规保存，备用。本实施例通过高渗溶液和胰酶的联合作用去除细胞得到无活性细胞存在的猪角膜基质胶原组织，极大的降低了抗原性，采用干燥剂非接触法进行去细胞猪角膜基质载体的脱水干燥，干燥后的载体胶原排列整齐，与正常角膜组织相似，载体复水后透明性好。实施例6新西兰兔治疗性板层角膜移植实验以实施例1制备的去细胞鸵鸟角膜基质载体为供体材料，选择体重2. 5Kg的健康新西兰兔为受体进行板层角膜移植手术，陆眠宁II肌注麻醉(麻醉剂量为0. 2mL/Kg)，术眼常规消毒，铺巾，开睑器开睑，上下直肌固定缝线，将供体材料(实施例1制备的去细胞鸵鸟角膜基质载体)用生理盐水复水20分钟，用7. 5mm环钻在受体角膜中央钻取约200 μ m深度，然后用角膜板层刀分离板层，形成植床，将植片(复水后的去细胞鸵鸟角膜基质载体) 置于植床，用10-0尼龙线(Alcon Laboratories, Fort Worth, TX)作16针间断缝合，球结膜下注射庆大霉素40000U加地塞米松2. 5mg，涂氧氟沙星眼膏，然后用3-0缝线褥式缝合眼睑。术后当日照片参见图5，从图中可以看出，植片植床缝合良好，植片透明。术后第3日拆睑缘线，每日应用抗生素或抗排斥滴眼液点眼1月，隔日裂隙灯下观察，术后3天受体角膜上皮形成，术后7天照片参见图6，从图中可以看出，植片较透明，有轻度水肿，结膜轻度充血，在左侧缝线处有轻度荧光素着色，其余部位上皮均已形成。术后6个月内未见排斥反应发生，生物相容性好，参见图7，从图中可以看出，角膜透明，无水肿及荧光素染色，结膜无充血，植片植床融合性好。实施例7板层人工生物角膜的构建
(1)基底膜化处理取实施例1制备的去细胞鸵鸟角膜基质载体，用含0. lg/L FN(纤维连接蛋白)的Hanks溶液或含0. lg/L FN的生理盐水浸泡载体，置于37°C培养箱孵育lh，然后将孵育后的去细胞异种角膜基质载体取出，放入含0. lg/L LN(层粘连蛋白) 的Hanks溶液或含0. lg/L LN的生理盐水中浸泡，置于37°C培养箱孵育lh，吸出液体，再将孵育后的去细胞异种角膜基质载体放入37°C培养箱内干燥lh，得到载体膜片，备用；(2)细胞接种无菌条件下摘取兔眼球，用含青霉素O00U/mL)和链霉素QOOU/ mL)的生理盐水反复冲洗兔眼球，剪下角膜缘，切除角膜缘上残存的结膜和色素组织，去除角膜内皮及大部分基质，将角膜缘切成lmmX2mm组织块，置于培养瓶中并使组织块的上皮面朝上，向培养瓶中加入细胞培养液，将培养瓶置于37°C，50mL/L的(X)2培养箱培养，根据代谢情况，3 4天换细胞培养液一次，当细胞密度达到80% 90%时，向培养瓶中加入含 0. 02wt% EDTA和 0. 25wt%胰酶的 D-Hanks 溶液，置于 37°C CO2 孵箱中消化 5min IOmin, 用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，在转速为2000rpm的条件下将培养瓶中的培养物离心两次，每次离心lOmin，弃去上清，加入含IOwt^胎牛血清的DMEM培养液，吹打制成细胞浓度为2 X IO5个细胞/mL的悬液，接种悬液于铺有步骤(1)中所述载体膜片的培养皿中，所述载体膜片的上皮面朝上，向培养皿中加入细胞培养液，培养条件与所述组织块在培养瓶中的培养条件相同，于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录；所述细胞培养液为常规DMEM/F12培养基1 1，另含200mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、4mmol/L谷氨酰胺、1000U/L胰岛素、5 μ g/L表皮生长因子和0. 118mmol/L腺嘌呤；(3)板层人工生物角膜的形成当细胞生长7 后，将生长有细胞的载体膜片置于 Transwell培养板中进行培养，细胞培养液及培养条件均与步骤( 相同，培养时载体膜片的底面浸于细胞培养液中，上皮面暴露于气体中，形成气液交界面，培养7 10天形成复层，构建得到板层人工生物角膜。实施例8全层人工生物角膜的构建(1)基底膜化处理取实施例1制备的去细胞鸵鸟角膜基质载体，用含0. lg/L FN(纤维连接蛋白)的Hanks溶液或含0. lg/L FN的生理盐水浸泡载体，置于37°C培养箱孵育lh，然后将孵育后的去细胞异种角膜基质载体取出，放入含0. lg/L LN(层粘连蛋白) 的Hanks溶液或含0. lg/L LN的生理盐水中浸泡，置于37°C培养箱孵育lh，吸出液体，再将孵育后的去细胞异种角膜基质载体放入37°C培养箱内干燥lh，得到载体膜片，备用；(2)内皮细胞接种无菌条件下摘取兔眼球，自角膜缘内侧Imm剪下全层角膜组织，将全层角膜组织置于培养皿中，用含青霉素O00U/mL)和链霉素O00U/mL)的无菌生理盐水冲洗，撕下全层角膜组织的后弹力膜，然后将全层角膜组织的内皮面朝上放入培养皿中，向培养皿中加入含0. 02wt% EDTA和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化15min 30min，用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，在转速为2000rpm的条件下将培养皿中的培养物离心两次，每次离心lOmin，弃去上清，加入含10wt%胎牛血清的DMEM培养液，吹打制成细胞浓度为2 X IO5个细胞/mL的悬液，接种悬液于铺有步骤⑴ 中所述载体膜片的培养皿中，所述载体膜片的内皮面朝上，向培养皿中加入含10wt%胎牛血清的DMEM培养液，370C CO2孵箱中培养，于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录，培养72h，将培养后的载体膜片翻转使内皮面朝下；
(3)上皮细胞接种无菌条件下摘取兔眼球，用含青霉素O00U/mL)和链霉素 (200U/mL)的生理盐水反复冲洗兔眼球，剪下角膜缘，切除角膜缘上残存的结膜和色素组织，去除角膜内皮及大部分基质，将角膜缘切成lmmX2mm组织块，置于培养瓶中并使组织块的上皮面朝上，向培养瓶中加入细胞培养液，将培养瓶置于37°C，50mL/L的(X)2培养箱培养，根据代谢情况，3 4天换细胞培养液一次，当细胞密度达到80% 90%时，向培养瓶中加入含0. 02wt % EDTA和0. 25wt %胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化5min IOmin,用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，在转速为2000rpm的条件下将培养瓶中的培养物离心两次，每次离心lOmin，弃去上清，加入含IOwt^胎牛血清的DMEM培养液，吹打制成细胞浓度为2X IO5个细胞/mL的悬液，接种悬液于步骤( 中翻转后的载体膜片上， 加入细胞培养液(同上)，培养条件与所述组织块在培养瓶中的培养条件相同，于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录；所述细胞培养液为常规DMEM/F12培养基1 1，另含200mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、4mmol/L谷氨酰胺、1000U/L胰岛素、Syg/L表皮生长因子和0. 118mmol/L腺嘌呤；(4)全层人工生物角膜的形成当细胞生长7 后，将生长有细胞的载体膜片置于 Transwell培养板中进行培养，细胞培养液及培养条件均与步骤( 相同，培养时载体膜片的底面浸于细胞培养液中，上皮面暴露于气体中，形成气液交界面，培养7 10天形成复层，构建得到全层人工生物角膜。本发明对制备的去细胞异种角膜基质载体进行了细胞毒性试验、溶血试验、致敏试验和眼部刺激试验，结果均符合国家相关标准。细胞毒性试验参照《中华人民共和国国家标准GB/T16886. 5-2003》的方法，对本发明的去细胞异种角膜基质载体进行细胞毒性试验，去细胞异种角膜基质载体组少量细胞呈圆形，疏松贴壁，无胞浆内颗粒，偶见细胞溶解。结合MTT法分析，表明去细胞异种角膜基质载体的细胞毒性为1级。溶血试验将本发明的去细胞异种角膜基质载体与灭菌的0. 9%氯化钠注射液混合，37°C恒温箱浸提对小时制得供试液；家兔心脏采血约10mL，除去纤维蛋白原，加生理盐水混勻后离心，重复多次至上清液不显红色为止，得到红细胞，用生理盐水将红细胞稀释成 2%的混悬液；将供试液与混悬液按梯度混合，观察4小时，均无溶血现象。致敏试验参照《中华人民共和国国家标准GB/T16886. 10-2005》及《中华人民共和国国家标准GB/T16886. 12-2005》的方法，对本发明的去细胞异种角膜基质载体进行豚鼠皮肤致敏试验，根据皮肤反应分级标准，结果表明，本发明的去细胞异种角膜基质载体对豚鼠皮肤无致敏反应。眼部刺激试验参照《中华人民共和国国家标准GB/T16886. 10-2005))的方法，对本发明的去细胞异种角膜基质载体进行大耳白家兔眼刺激试验，根据反应分级标准，结果表面，本发明的去细胞异种角膜基质载体对大耳白家兔眼睛潜在性无刺激反应。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
1权利要求
1.一种去细胞异种角膜基质载体，其特征在于，该载体是经高渗溶液联合酶消化法去除上皮细胞及基质细胞后的动物板层角膜；该载体的制备方法包括以下步骤(1)动物眼球的摘取和保存摘取动物眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的动物眼球置于湿房中，4°C 8°C保存，24小时内进行板层角膜的剖切；(2)板层角膜的剖切用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1) 中保存的动物眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径5mm 12mm的刻度环钻钻取 150 μ m 400 μ m厚的板层角膜；(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞301、将步骤O)中所述板层角膜放入高渗溶液中，在温度为25°C 40°C条件下浸泡1 天 3天；所述高渗溶液为质量浓度3% 20%的NaCl水溶液；302、将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于含胰酶的缓冲溶液中，在温度为25°C 40°C条件下浸泡1天 4天，所述含胰酶的缓冲溶液中胰酶的质量百分含量为0. 05% 0. 35% ；或者将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于胰酶替代物中，在温度为25°C 40°C条件下浸泡1天 4天；所述缓冲溶液为D-Hanks溶液，所述胰酶替代物为TrypLE Express ；303、将302中浸泡后的板层角膜取出后用去离子水洗涤3次，得到去细胞异种角膜基质载体；(4)干燥处理将303中所述去细胞异种角膜基质载体置于无菌平皿中，然后一同放入装有干燥剂的干燥器中，密封，室温下干燥脱水1天 3天，所述干燥剂为无水氯化钙；(5)消毒处理将步骤(4)中干燥后的去细胞异种角膜基质载体置于无菌瓶中，密封， 然后采用Co 60辐射进行消毒处理，辐射照射总剂量为25kGy ；(6)保存将步骤(5)中经消毒处理后的去细胞异种角膜基质载体在室温条件下常规保存，备用。
2.根据权利要求1所述的去细胞异种角膜基质载体，其特征在于，所述动物为猪、牛或鸵鸟。
3.一种制备如权利要求1或2所述的去细胞异种角膜基质载体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)动物眼球的摘取和保存摘取动物眼球，用生理盐水冲洗眼球，将冲洗后的动物眼球置于湿房中，4°C 8°C保存，24小时内进行板层角膜的剖切；(2)板层角膜的剖切用生理盐水和含400U/mL妥布霉素的生理盐水交替冲洗步骤(1) 中保存的动物眼球，然后在手术显微镜下无菌操作，用直径5mm 12mm的刻度环钻钻取 150 μ m 400 μ m厚的板层角膜；(3)高渗溶液联合酶消化法去除板层角膜上皮细胞及基质细胞301、将步骤O)中所述板层角膜放入高渗溶液中，在温度为25°C 40°C条件下浸泡1 天 3天；所述高渗溶液为质量浓度3% 20%的NaCl水溶液；302、将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于含胰酶的缓冲溶液中，在温度为25°C 40°C条件下浸泡1天 4天，所述含胰酶的缓冲溶液中胰酶的质量百分含量为0. 05% 0. 35% ；或者将301中浸泡后的板层角膜取出后放置于胰酶替代物中，在温度为25°C 40°C条件下浸泡1天 4天；所述缓冲溶液为D-Hanks溶液，所述胰酶替代物为TrypLEExpress ；`303、将302中浸泡后的板层角膜取出后用去离子水洗涤3次，得到去细胞异种角膜基质载体；(4)干燥处理将303中所述去细胞异种角膜基质载体置于无菌平皿中，然后一同放入装有干燥剂的干燥器中，密封，室温下干燥脱水1天 3天，所述干燥剂为无水氯化钙；(5)消毒处理将步骤(4)中干燥后的去细胞异种角膜基质载体置于无菌瓶中，密封， 然后采用Co 60辐射进行消毒处理，辐射照射总剂量为25kGy ；(6)保存将步骤(5)中经消毒处理后的去细胞异种角膜基质载体在室温条件下常规保存，备用。
4.根据权利要求3所述的去细胞异种角膜基质载体的制备方法，其特征在于，步骤301 中所述NaCl水溶液的质量浓度为8% 12%。
5.一种如权利要求1或2所述的去细胞异种角膜基质载体作为角膜移植供体在角膜移植中的应用。
6.根据权利要求5所述的去细胞异种角膜基质载体作为角膜移植供体在角膜移植中的应用，其特征在于，应用方法为对需进行角膜移植的受体进行麻醉，术眼常规消毒，铺巾，开睑器开睑，上下直肌固定缝线，将去细胞异种角膜基质载体用生理盐水复水20分钟， 用环钻在受体角膜中央钻取，然后用角膜板层刀分离板层，形成植床，将复水后的去细胞异种角膜基质载体置于植床，用10-0尼龙线缝合，球结膜下注射庆大霉素40000U加地塞米松 2. 5mg，涂氧氟沙星眼膏，然后用3-0缝线褥式缝合眼睑，角膜移植手术完成。
7.—种如权利要求1或2所述的去细胞异种角膜基质载体作为人工生物角膜支架在全层或板层人工生物角膜构建中的应用。
8.根据权利要求7所述的去细胞异种角膜基质载体作为人工生物角膜支架在板层人工生物角膜构建中的应用，其特征在于，所述板层人工生物角膜的构建方法包括以下步骤(1)基底膜化处理将去细胞异种角膜基质载体放入含0.lg/L纤维连接蛋白的Hanks 溶液或含0. lg/L纤维连接蛋白的生理盐水中，并置于37°C培养箱中孵育lh，然后将孵育后的去细胞异种角膜基质载体取出，放入含0. lg/L层粘连蛋白的Hanks溶液或含0. lg/L层粘连蛋白的生理盐水中，并置于37°C培养箱孵育lh，吸出液体，再将孵育后的去细胞异种角膜基质载体置于37°C培养箱内干燥lh，得到载体膜片，备用；(2)上皮细胞接种无菌条件下摘取兔眼球，用含200U/mL青霉素和200U/mL链霉素的生理盐水反复冲洗兔眼球，剪下角膜缘，切除角膜缘上残存的结膜和色素组织，去除角膜内皮及基质，然后将角膜缘切成ImmX2mm的组织块，置于培养瓶中并使组织块的上皮面朝上，向培养瓶中加入细胞培养液，置于37°C，50mL/L的(X)2培养箱培养，根据代谢情况，3 4天换细胞培养液一次，当细胞密度达到80% 90%时，向培养瓶中加入含0. 02wt% EDTA 和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化5min lOmin，用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，在转速为2000rpm的条件下将培养瓶中的培养物离心两次， 每次离心lOmin，弃去上清，加入含IOwt %胎牛血清的DMEM培养液，吹打制成细胞浓度为 2X105个细胞/mL的悬液，接种悬液于铺有步骤(1)中所述载体膜片的培养皿中，所述载体膜片的上皮面朝上，向培养皿中加入细胞培养液，培养条件与所述组织块在培养瓶中的培养条件相同，于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录；所述细胞培养液为常规 DMEM/F12培养基1 1，另含200mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、4mmol/L 谷氨酰胺、1000U/L胰岛素、5μ g/L表皮生长因子和0. 118mmol/L腺嘌呤；(3)板层人工生物角膜的形成当细胞生长7 后，将生长有细胞的载体膜片置于 Transwell培养板中进行培养，细胞培养液及培养条件均与步骤( 相同，培养时载体膜片的底面浸于细胞培养液中，上皮面暴露于气体中，形成气液交界面，培养7 10天形成复层，构建得到板层人工生物角膜。
9.根据权利要求7所述的去细胞异种角膜基质载体作为人工生物角膜支架在全层人工生物角膜构建中的应用，其特征在于，所述全层人工生物角膜的构建方法包括以下步骤(1)基底膜化处理将去细胞异种角膜基质载体放入含0.lg/L纤维连接蛋白的Hanks 溶液或含0. lg/L纤维连接蛋白的生理盐水中，并置于37°C培养箱中孵育lh，然后将孵育后的去细胞异种角膜基质载体取出，放入含0. lg/L层粘连蛋白的Hanks溶液或含0. lg/L层粘连蛋白的生理盐水中，并置于37°C培养箱孵育lh，吸出液体，再将孵育后的去细胞异种角膜基质载体置于37°C培养箱内干燥lh，得到载体膜片，备用；(2)内皮细胞接种无菌条件下摘取兔眼球，自角膜缘内侧Imm剪下全层角膜组织，将全层角膜组织置于培养皿中，用含200U/mL青霉素和200U/mL链霉素的无菌生理盐水冲洗，撕下全层角膜组织的后弹力膜，然后将全层角膜组织的内皮面朝上放入培养皿中，向培养皿中加入含0. 02wt% EDTA和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化 15min 30min，用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，在转速为2000rpm的条件下将培养皿中的培养物离心两次，每次离心lOmin，弃去上清，加入含IOwt^胎牛血清的DMEM培养液，吹打制成细胞浓度为2 X IO5个细胞/mL的悬液，接种悬液于铺有步骤(1)中所述载体膜片的培养皿中，所述载体膜片的内皮面朝上，向培养皿中加入含10wt%胎牛血清的DMEM 培养液，370C CO2孵箱中培养，于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录，培养72h， 将培养后的载体膜片翻转使内皮面朝下；(3)上皮细胞接种无菌条件下摘取兔眼球，用含200U/mL青霉素和200U/mL链霉素的生理盐水反复冲洗兔眼球，剪下角膜缘，切除角膜缘上残存的结膜和色素组织，去除角膜内皮及基质，然后将角膜缘切成ImmX2mm的组织块，置于培养瓶中并使组织块的上皮面朝上，向培养瓶中加入细胞培养液，置于37°C，50mL/L的(X)2培养箱培养，根据代谢情况，3 4天换细胞培养液一次，当细胞密度达到80% 90%时，向培养瓶中加入含0. 02wt% EDTA 和0. 25wt%胰酶的D-Hanks溶液，置于37°C CO2孵箱中消化5min lOmin，用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，在转速为2000rpm的条件下将培养瓶中的培养物离心两次， 每次离心lOmin，弃去上清，加入含IOwt %胎牛血清的DMEM培养液，吹打制成细胞浓度为 2X IO5个细胞/mL的悬液，接种悬液于步骤O)中翻转后的载体膜片上，加入细胞培养液， 培养条件与所述组织块在培养瓶中的培养条件相同，于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录；所述细胞培养液为常规DMEM/F12培养基1 1，另含200mL/L胎牛血清、IOOU/ mL青霉素、100U/mL链霉素、4mmol/L谷氨酰胺、1000U/L胰岛素、5 μ g/L表皮生长因子和 0. 118mmol/L 腺嘌呤；(4)全层人工生物角膜的形成当细胞生长7 后，将生长有细胞的载体膜片置于Transwell培养板中进行培养，细胞培养液及培养条件均与步骤( 相同，培养时载体膜片的底面浸于细胞培养液中，上皮面暴露于气体中，形成气液交界面，培养7 10天形成复层，构建得到全层人工生物角膜。
全文摘要
本发明公开了一种去细胞异种角膜基质载体及其制备方法和应用，该载体是经高渗溶液联合酶消化法去除上皮细胞及基质细胞的动物板层角膜，载体的制备方法为首先取新鲜动物眼球，在手术显微镜下无菌操作，用直径5mm～12mm的刻度环钻钻取150μm～400μm厚的板层角膜，然后在高渗溶液和胰酶/胰酶替代物的联合作用下去除细胞，最后脱水干燥得到去细胞异种角膜基质载体，保存，备用。该去细胞异种角膜基质载体可作为角膜移植供体直接进行治疗性角膜移植，也可作为人工生物角膜支架进行全层或板层的人工生物角膜的构建。本发明制备的去细胞异种角膜基质载体具有以下特点胶原排列整齐，与正常角膜组织相似，复水后透明性好。
文档编号A61L27/36GK102294053SQ20111020730
公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月24日 优先权日2011年7月24日
发明者刘先宁, 吴洁, 朱秀萍, 杨华, 潘士印, 肖湘华, 银勇 申请人:陕西省眼科研究所