激发后第7天对动物实施安乐死，并将其肺从胸腔内完整移 出。通过使用与去掉了针头的管道输注装置（Butterfly19X7/8 12"tubing,Abbott Laboratories,Chicago,IL)连接的20cc塑料注射器将Dulbecco's磷酸盐缓冲溶液 (Mediatech)注入右中肺叶来从每个肺中获得支气管肺泡（BAL)液样品。将管插入到通向 右中肺叶的支气管中并用线将二者绑在一起以避免渗漏。然后，将l〇mlDulbecco's磷酸 盐缓冲溶液轻轻推入肺叶。在轻轻按摩被灌洗的肺叶之后，通过缓慢缩回活塞将液体移出。 通常可容易地回收一半（5ml)输注液。然后将BAL液转移至无菌的15ccFalcon聚丙稀锥 形管（BectonDickinson，FranklinLakes，NJ)并保存在4°C，收集后在4°C下保存不超过 4h。然后通过在2000rpm离心lOmin，使所述BAL液澄清，将所获得的液体分成lml等分试 样。装在无菌的无RNA酶和DNA酶 & 热原的 1.7mlPosi-Click管（DenvilleScientific) 中并贮存于_80°C直到用于检测病毒载量。
[0166] 检测病毒血症，并使用下文中所述引物使用定量RT-PCR来测量。使用QIAamp病毒 RNAmini试剂盒（Qiagen,Chatsworth,CA)，根据制造商的使用说明和下文所述，从血清样 品中提取RNA，所述血清样品获得自用NADC-20病毒激发后第7天时接种PRRS病毒的猪和 未接种的猪。在1. 5mlEppendorf管中使140μ1每种样品与560μ1包含5. 6μ1载体RNA 的缓冲液AVL合并，脉冲涡旋15秒并在室温下孵育10min。向每个管中加入560μ1 100% 乙醇，将内容物脉冲涡旋15秒并以6000Xg离心10秒。将630μ1每种混合物加到QIAamp Mini旋转柱的上表面，并以8000Xg离心lmin。弃掉洗脱液，对每种混合物的剩余部分重 复所述过程。然后用500μ1缓冲液AW1 (8000Xg，lmin)和500μ1缓冲液AW2 (20000Xg， 3min)依次冲洗每个柱。之后，将干燥的柱以20000Xg离心lmin，然后向每个柱加入60μ1 缓冲液AVE。在室温下孵育lmin之后，在以6000Xg离心lmin的过程中将RNA洗脱到1. 5ml Eppendorf管中。将洗脱的RNA贮存于-80°C直到需要时。
[0167]在0·5μΜ反向互补引物（CACACGGTCGCCCTAATTG)(SEQIDN0:27)、50mMTris(pH 8· 3)、75mMKCl、3mMMgCl2、10mMDTT、各 0· 5mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，以及 25 个单 位的小鼠鼠白血病病毒逆转录酶（Promega,Madison,WI) /μ1反应物的存在下，对血清RNA 样品进行反转录。在0.5mlEppendorf管或0.2mlPCR管中的RNA和引物在70°C下变性 10min并在4°C下冷却2min之后，加入其他组分。对全部混合物进行一个循环的25°C下 10min、一个循环的45°C下50min和一个循环的70°C下15min(随机六聚物引物），或者进行 一个循环的42°C下60min和一个循环的70°C下15min。将所获得的cDNA贮存于-80°C直 到需要时。
[0168]使用TaqManUniversalPCRMasterMix、ABISDS7000 仪器（Applied Biosystems,FosterCity,CA)、正向引物TGGTGAATGGCACTGATTGAC(SEQIDN0:28)、以上所 述的反向引物和TaqMan探针6-FAM-TGTGCCTCTAAGTCACC(SEQIDN0:29)(其中FAM是6-羧 基荧光素），在反应混合物中进行用于扩增/检测PRRSV基因组的实时PCR。使用Primer Express(2.0版本）软件（AppliedBiosystems)设计引物和探针，并分别从Integrated DNATechnologies,Inc. (IDT,Coralville,ΙΑ)和AppliedBiosystems购买。通过比较所 获得的阈值循环（CT)值与使用已知量的RNA转录产物产生的标准曲线来测定PRRS病毒 RNA拷贝数，所述已知量的RNA转录产物对应于PRRS病毒毒株G16X基因组的约9%的:V 末端区域。
[0169] 从伊利诺伊大学兽医学院猪研究农场（伊利诺伊州厄巴纳）中的无PRRS病毒的 猪群中获得30只35±2日龄的杂交育种（YorkshireXLandrace)猪。将这些猪随机分配 到伊利诺伊大学生物控制设施的隔间（η= 3只猪/隔间）。在隔间中保持24°C到28°C的 热型气候。用基于玉米的II期饮食喂养猪，所述饮食提供满足或超过高度瘦型猪的预估需 求的营养浓度。根据生物医学分级措施在10个182X243cm隔间中圈养所述动物（每组3 只猪），保持12h光照/黑暗周期并使其任意饮水和进食。在适应环境5天之后，使用2ml 包含lOUTCIDa/ml的G16X-P3、794A61-P2或111698病毒的悬液在臀部区域经肌肉内途径 对6个隔间中的动物进行一次注射，每种疫苗病毒共2个隔间（η= 6只猪）。使用2ml稀 释剂（补充了 0.5%猪血清的PBS)对其他两个隔间中的6只动物进行模拟接种。剩余两个 隔间中的6只猪未被免疫并被用作严格对照。在接种后第39. 5±0. 5天，用l(f3TCID5。的 有毒力的PRRS病毒分离株NADC-20激发所有被免疫的动物以及6只模拟接种的猪。所述 激发接种物由4ml浓度为104〃TCID5Q/ml的NADC-20病毒组成，其是以2ml剂量经鼻内和肌 肉内途径给予。在病毒激发前不久和激发后第7天测定每只动物的体重。从激发当天直至 之后7天的时期内，每天监测动物的活力的改变和呼吸性窘迫的征象。在临激发和激发后 第7天采集血清样品，并使用定量实时PCR通过测定每ml血清中PRRS病毒基因组的量来 确定病毒血症的水平。激发后7天对动物实施安乐死并将其肺从其胸腔完整移出。从右中 肺叶采集BAL样品并通过在ZMAC细胞中滴定来测定其中传染性病毒的量。
[0170] 如下进行统计学分析。应用一般线性模型单变量措施和Fisher' sLSD检验来评 估组之间关于病毒血症的程度（病毒基因组拷贝数/ml)和肺中传染性病毒的量（TCID5。/ ml)的差异。为了进行分析，将这两个测量值都转化为loglO数值并与模拟接种-激发组的 组平均值对比。使用Dunnett'st检验（双侧）对在病毒激发之前和之后接种的猪的差异 性体重改变与参照模拟接种-激发组中测定的相同参数进行比较。使用统计学的SAS?. 软件（Cary，NC)进行分析。P值〈0.01被认为是统计学上显著的。
[0171] 为了评估PRRS病毒毒株794A61、111698和G16X的疫苗效力，用这些病毒之一对 猪进行免疫或对猪进行模拟接种，约5. 5周之后用有毒力的"急性PRRS"毒株NADC-20激发。 另一组猪保持未感染PRRS病毒的状态并作为严格对照。在激发当天，研究中全部30只猪的 平均体重为49. 9±3kg。在对三个接种组的任何一组与模拟接种组或严格对照组所确立的 平均体重之间未发现显著差异。因此，暴露于所述三种疫苗毒株的任一种对动物生长没有 明显影响。相比之下，用NADC-20病毒接种未免疫接种的动物与在接下来的7天内它们可能 的生长的急剧减少相关，这可由微小的3± 1. 6%体重改变来证明，该体重改变值为严格对 照组的平均18. 5±1. 54%的体重增加的1/6(图7)。同样，在这点上，用794A61疫苗对猪 进行免疫是不成功的，因为这些用病毒激发的动物经历的平均体重增加为5. 7±1. 5%，其 与病毒激发的模拟接种组的记录值没有统计学上的差异（P>〇.4)。但是，与该对照组相比， 先用G16X或111698病毒对动物进行接种显著（p< 0. 001)抵消了用NADC-20病毒进行激 发的负面效应--这两组的平均体重增加分别为9. 8±0. 54%和10. 5±1. 1% (图7)。
[0172] 测定了PRRS病毒接种对NADC-20病毒激发的猪中病毒血症水平的影响。如所预 期的，在NADC-20病毒激发后第7天对严格对照的猪和其他动物进行血清取样时，未直接暴 露于PRRS病毒的严格对照的猪的血清中没有可测量数量的传染性病毒。因此，未发生隔间 之间的交叉污染。同样，此时在用G16X病毒接种的任何一只猪的血清中明显没有传染性病 毒。另一方面，全部6只模拟接种动物以及分别用794A61或111698接种的6只组成员中的 3只和4只动物的血清中容易地检测到传染性PRRS病毒。为了更准确地测定这些动物-- 特别是G16X接种组中似乎为PRRS病毒阴性的成员一一中病毒血症的水平，使用定量实时 PCR测定（图8)。如所预期的，在任何的严格对照的猪的血清中未检测到PRRS病毒基因组。 相比之下，病毒激发的模拟接种动物的血清中具有非常高的病毒载量，组平均值为1〇 7·85病 毒基因组拷贝/mL。对于用794A6U111698或G16X病毒进行免疫的猪，其病毒血症的水平 显著更低（P< 〇. 001)，如分别为1〇6Λ1〇5·°和10 4·6病毒基因组拷贝/mL的各组平均值所 示的。应当注意的是，通过使用这种非常灵敏的测定，在用111698和G16X病毒接种的6只 动物中的2只和3只动物的血清中无法检测到PRRS病毒基因组。
[0173] 测定PRRS病毒接种对NADC-20病毒激发的猪的肺部中病毒载量的影响。在用 NADC-20病毒激发后第7天，从之前模拟接种或用794A61或111698病毒进行免疫的猪的 肺部采集的BAL液具有相似量的传染性病毒，其统计学上相似的组平均值分别为104·5、10 4·8 和104々CID5Q/ml(图9)。相比之下，来自G16X病毒接种组的BAL液样品具有l(f4TCID5。/ ml的平均效价，其显著小于（p〈0. 005)对模拟接种组所测定的数值。此外，用G16X病毒接 种的一只猪的BAL液中缺少可检测的传染性病毒，表明所述激发病毒已被从其体内清除。
[0174] 根据所述结果可确定，可合理地将几乎同基因的PRRS病毒毒株794A61、111698和 G16X的疫苗效力分别评定为差、中等和良好的等级。
[0175] 实施例5
[0176]G16XPRRS病毒疫苗
[0177] 实施例5.本实施例说明了G16X病毒的为用这种病毒接种并用不同谱系（即谱系 1)的有毒力的2型PRRS病毒激发的猪提供异源的保护性免疫的能力。在本研究中，检测了 两种PRRS疫苗病毒的效力。用疫苗候选物G16X接种一组动物。用市售的IngelvacPRRS MLV接种第二组猪。本研究是双盲、安慰剂对照研究。为了实现盲法实验（masking)，对参 与日常观察、临床评分、总体和显微结构肺病理学评估、样品处理以及实验结果解释的全体 人员在整个实验阶段研究中保持盲法实验。
[0178] 从伊利诺伊大学兽医学研究农场购买24只6周龄猪。已知该农场的猪群未感染 所有主要的猪病原体，包括PRRS病毒、流感病毒、支原体和环病毒。在研究开始之前通过血 清学确认研究动物中PRRS抗体的阴性状态。在全部24只动物的耳上做标记，并将其随机 指定到处理组（4组，每组6只猪），然后将其转移到BSL2动物控制设施。将被分配到同一 处理组的所有猪（6只猪）圈养在一起。在7天适应期之后，根据以下的处理安排对每组猪 进行接种：
[0179] 组1 :对假疫苗组的每只猪经肌肉内注射2ml疫苗稀释剂。
[0180] 组2:该组的每只猪接受1个剂量的IngelvacPRRSMLV(系列号：245-D45)。根 据制造商的使用说明将所述疫苗复原并通过肌肉内途径给药（对接种物的滴定表明给药 的总剂量为4X104TCID50)。
[0181] 组3 :该组的每只猪接受2ml的肌肉内注射，其包含总计4X104TCID5。的G16X活 PRRS病毒疫苗。
[0182] 第4组作为严格（环境）对照并且未被接种。接种后28天，用4X104TCID5。高毒 力的PRRS病毒分离株LTX1激发组1、2和3中的全部动物。根据对GP5基因核苷酸序列的 系统发生分析，LTX1病毒被认为属于2型（北美样）PRRSV的谱系1。LTX1病毒的GP5与所 使用的两种疫苗中的任一种具有〈88%的同源性。LTX1病毒是在2012年从伊利诺伊州的一 个遭受严重的PRRS病毒爆发的母猪农场中分离。观察到的症状的特征在于受孕率为60%、 晚期流产和死产。此外，在6周的时期内断奶前死亡率（pre-weanmortality)为100%，之 后的2周内断奶前猪的死亡率为80%。这次爆发如此严重，以致农场主和主治兽医决定减 少农场中猪的数量。使用鼻喷雾器经鼻内途径给予一半剂量的激发病毒，通过肌肉内注射 给予另一半剂量的激发病毒。随后在接下来的14天，每天监测动物的临床征象。在病毒激 发不久和激发后第7、10和14天采集血液样品。在激发当天和激发后第7、10和14天记录 体重。在激发后第14天，对所有动物实施安乐死并检查肺部的总体病理学。取样进行组织 病理学并进行支气管肺泡灌洗。使用的所有方法为本领域中之前所记载的方法，除了使用 猪肺泡巨噬细胞细胞系ZMAC来检测所采集的BAL液中传染性病毒载量之外。
[0183]a.用G16X病毒进行的接种在接种后4天刺激了强的干扰素α应答
[0184] 在本研究中，发现G16X病毒具有独特的生物学特性，即将G16X疫苗病毒经肌肉 内给予猪之后4天，在猪的血清中可检测到强烈的全身性干扰素α应答。该应答在4天 后（接种后第8天）减退并且在接种后第14天仍然存在（图13)。相比之下，用Ingelvac PRRSMLV疫苗接种的猪在应答高峰时期（接种后第4天）表现出低得多（4倍）的应答并 且到第14天检测不到所述应答。这些结果确认了，在猪对G16X病毒暴露的干扰素α应答 方面，G16X病毒具有独特的生物型。
[0185]b.G16X疫苗在用高毒力的PRRS病毒激发的猪的体重增加方面的效力
[0186] 激发时，本研究中24只猪的平均体重是51 ±4kg，并且组之间平均体重没有差异。 同样，在用商用的PRRSMLV疫苗或G16X病毒进行免疫的动物中未观察到临床征象。这些 结果表明，同市售的MLV疫苗一样，来源自天然无毒力病毒的G16X病毒也是无毒力的。因 此，暴露于疫苗G16X或IngelvacPRRSMLV对猪的生长或健康没有明显影响。
[0187] 为了测量由两种被检验的疫苗引起的对猪生长的保护性免疫，从病毒激发当天到 病毒激发后第7、10和14天计算每只动物的体重增加百分数。未激发（严格对照）组的猪 表现出稳定生长率，在14天内平均增加32% (图14)。与严格对照组相比，用PRRS病毒 LTX1感染模拟接种猪使其生长率显著降低并导致从激发后第7天到第10天的净体重减少。 之后动物的体重开始增加，最终与激发时相比体重增加14% (图14)。之前用任何一种疫 苗对动物进行免疫都抵消了用LTX1病毒激发所带来的负面影响一一接受任何一种疫苗的 组表现出相似的平均体重增加，其在激发后第7、10和14天分别为约12%、19%和29%。
[0188]c.G16X疫苗在控制用异源的高毒力PRRS病毒感染的猪中病毒血症方面的效力
[0189] 激发时（接种后第28天），实验中所有猪的血清中都不具有可检测的传染性病毒。 在激发后第7、10和14天，所有进行模拟接种然后用LTX1病毒激发的动物表现出高水平的 病毒血症（图15)。在激发后第7天，两个接种组的所有猪都具有病毒血症，这两个组之间 没有显著差异。但是，到第10天，用G16X病毒接种的5只猪中仅有1只仍然有病毒血症。 相比之下，用IngelvacPRRSMLV接种的6只动物中的5只有病毒血症。到接种后第14天， 两个接种组的所有动物的血流中都不再有可检测的传染性病毒。
[0190]d.G16X疫苗在控制用高毒力PRRS病毒感染的猪的肺中病毒载量方面的效力
[0191] 在用LTX1病毒激发后第14天，好不令人吃惊的，对于未接种组的全体成员，在猪 的BAL液中发现了最大的病毒载量（图16,平均值为l(fsTCIDM/ml)。此时，用在ZMAC细 胞中生长的G16X病毒进行免疫的5只动物中仅有3只在其BAL液中仍有可检测量的PRRS 病毒。这三只阳性动物的平均病毒载量为l(f9TCID5Q/ml。这代表与未接种并激发的对照猪 的肺中存在的组平均病毒量相比组平均病毒量下降>700倍。相比之下，用IngelvacPRRS MLV接种的6只猪中的5只的BAL液中仍可检测到传染性病毒。此外，在这5只阳性动物中 其平均病毒载量为l(fsTCIDM/ml，其约为G16X病毒免疫的免疫组的测定值的10倍。
[0192] 总之，本实施例说明，与商用的MLV疫苗类似，G16X病毒没有毒力，但是在用不同 谱系的有毒力的2型PRRS病毒异源激发时，G16X的效力比市售的MLV疫苗更优异。
[0193] 实施例6
[0194] 序列信息
[0195] 实施例6.本发明的实施方案可涉及一个或多个核酸或蛋白序列，其包括本文所 记载的项目。任何序列信息（包括以电子格式单独提交的序列信息）被认为是本说明书的 一部分并以引用的形式纳入本文。
[0196]表 3.SEQIDN0:1
[0197]
【主权项】
1. 一种分离的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)病毒，其中所述病毒的基因组编码选自以 下的蛋白：在相对于SEQIDNO: 25的第31位包含缬氨酸的E蛋白、在相对于SEQIDNO: 25 的第60位包含丙氨酸的E蛋白，以及在相对于SEQIDNO:21的第94位包含缬氨酸的GP3 蛋白。2. 权利要求1的病毒，其中所述病毒的基因组编码在相对于SEQIDNO:25的第31位 包含缬氨酸和第60位包含丙氨酸的E蛋白，以及在相对于SEQIDNO: 21的第94位包含缬 氨酸的GP3蛋白。3. 权利要求2的病毒，其中所述病毒的基因组包含SEQIDNO: 1的序列或其RNA等价 序列。4. 一种疫苗，其包括权利要求1的病毒和可药用载体。5. 权利要求4的疫苗，其还包括免疫佐剂。6. 权利要求5的疫苗，其中所述免疫佐剂选自干扰素α、干扰素β、白细胞介素-12、 白细胞介素-15、白细胞介素18、编码干扰素α的核酸、编码白细胞介素-12的核酸、编码 白细胞介素-15的核酸、编码白细胞介素18的核酸、编码干扰素β的核酸、诱导或增强干 扰素α的活性的物质、诱导或增强干扰素β的活性的物质、多聚1C和多聚ICLC。7. -种在哺乳动物中诱导特异性针对PRRS病毒的免疫应答的方法，所述方法包括将 权利要求4的疫苗给予有此需要的哺乳动物。8. 权利要求7的方法，其中所述疫苗还包括免疫佐剂。9. 权利要求8的方法，其中所述免疫佐剂选自干扰素α、干扰素β、白细胞介素-12、 白细胞介素-15、白细胞介素18、编码干扰素α的核酸、编码白细胞介素-12的核酸、编码 白细胞介素-15的核酸、编码白细胞介素18的核酸、编码干扰素β的核酸、诱导或增强干 扰素α的活性的物质、诱导或增强干扰素β的活性的物质、多聚1C和多聚ICLC。10. 权利要求7的方法，其中在给予所述疫苗的同时、给予所述疫苗后24小时内或给予 所述疫苗前24小时内给予免疫佐剂。11. 权利要求7的方法，其中所述给予是肌肉内、真皮内、粘膜、口服、舌下、眼内、鼻内、 静脉内、腹膜内、局部或经皮肤给药。12. 权利要求11的方法，其中所述给予是肌肉内给药。13. 权利要求7的方法，其中所述哺乳动物是猪。14. 一种分离的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)病毒，所述病毒以ATCC专利保藏号 PTA-120658保藏在美国典型菌种保藏中心。
【专利摘要】本文提供了涉及猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒、包括所述病毒的组合物和使用所述病毒的方法的实施方案。所述病毒可被用于免疫包括猪在内的哺乳动物。本文提供了通过给予包括所述病毒的组合物而在猪中产生针对PRRS病毒的免疫应答的方法。PTA-12065820131022
【IPC分类】C12N7/00, A61K39/12
【公开号】CN105308178
【申请号】CN201380072565
【发明人】F·祖克曼, G·卡尔扎达-诺瓦, W·施尼茨莱恩
【申请人】伊利诺伊大学评议会
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2013年12月3日
【公告号】CA2892948A1, EP2929018A1, EP2929018A4, US9149518, US20140161768, US20160074503, WO2014089117A1