Aamp病毒RNAmini试剂盒 (Qiagen,Chatsworth,CA)，根据制造商以下所述的使用说明，从PRRS病毒原液 89-46448-40MA104/2、G16XP2、794A61P1 和 111698(如上文所述）的样品中提取RNA。在 1. 5mlEppendorf管中使140μ1的每种样品与560μ1包含5. 6μ1载体RNA的缓冲液AVL 结合，加脉冲涡旋15秒并在室温下孵育lOmin。向每个管中加入560μ1 100%乙醇，对内容 物进行脉冲涡旋15秒并以6000Xg离心10秒。将630μ1的每种混合物加到QIAampMini 旋转柱的上表面，并以8000Xg离心lmin。弃掉洗脱液，对每种混合物的剩余部分重复所 述过程。然后依次用500μ1缓冲液AW1 (8000Xg，lmin)和500μ1缓冲液AW2 (20000Xg， 3min)冲洗每个柱。之后，将干燥的柱子以20000Xg离心lmin，然后向每个柱中加入60μ1 缓冲液AVE。在室温下孵育lmin之后，在以6000Xg离心lmin过程中将RNA洗脱到1. 5ml Eppendorf管中。将洗脱的RNA贮存于-80°C直到需要时。
[0141] 如下法进行PRRS病毒基因组RNA的反转录（RT)和聚合酶链式反应（PCR)扩增。在 每μ1 反应物中存在 50μΜ随机六聚物（Invitrogen,Carlsbad,CA)、50mMTris(pH8. 3)、 75mMKCl、3mMMgCl2、10mMDTT、各 0· 5mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，以及 25 个单位的 小鼠鼠白血病病毒逆转录酶（Promega,Madison,WI)的情况下进行PRRS病毒89-46448-40 MA104/2和794A61PIRNA的反转录。用于PRRS病毒G16XP2和111698基因组的RT的 反应混合物的组成相同，除了用0. 5μΜRTREV引物（CAACTGCAGAGCTCATATGCAT)(SEQID N0:30)或其序列与所述病毒基因组RNA互补的其他引物替代所述随机六聚物引物之外。在 0.5mlEppendorf管或(X2mlPCR管中的RNA和引物在70°C变性10min并在4°C冷却2min 之后，加入其他组分。对全部混合物进行一个循环的25°C10min、一个循环的45°C50min和 一个循环的70°C15min(随机六聚物引物），或者进行一个循环的42°C60min和一个循环的 70°C15min。将所获得的cDNA贮存于-80°C直到需要时。
[0142] 在12. 5或25μ1反应混合物中进行PRRSVcDNA的PCR扩增以获得用于核苷酸测 序的扩增子。它们的组成是相同的，并且是由1μ1CDNA(按照上述方法制备）和0. 25单 位的IPR00F?高保真DNA聚合酶（Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)/12. 5μ1 反应混 合物、1XIPR00F?HF缓冲液，以及各0. 2mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP组成。在加入PRRS 病毒特异性正向和反向引物至终浓度为〇. 45mM之前，将0. 2mlPCR管中的PCR反应混合物 保持在70°C热循环仪中或保持在4°C冰上。在后一种情况下，然后立即将样品转移到预加 热至70°C的热循环仪中。对于扩增，使样品进行一个循环的98°C下变性30秒，37个循环 的98°C下变性10秒、56°C至58°C下引物退火30秒和72°C下产物延伸l_3min，以及一个循 环的72°C下5min。将所获得的扩增子贮存于-20°C直到在0.7%琼脂糖凝胶中电泳。使用 长波紫外光（366nm)使代表具有预期大小的扩增子的溴化乙锭染色的条带可视化，将该条 带切下，使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒（ΖΥΜ0Research,Orange,CA)进行纯化并从 Zymo旋转I柱中将每个样品洗脱到10μ1无RNA酶的水中。
[0143] 在用于核苷酸序列分析的制备中，将2. 8μ1每种纯化的扩增子的等分试样 与 5. 2μ1 12. 5 % 的甘油、2. 0μ1 5Χ测序缓冲液（400mMTris,pH9. 0, 10mMMgCl2) 和 1·0μ1BIGDYE?Terminatorv3.0orν3·1 循环测序RR_24(Applied Biosystems，Austin，TX)合并到0.2mlPCR管中并保持在4°C。加入各个测序引物至终浓 度为1. 5mM之后，将每个管转移到预加热至70°C的热循环仪中。然后对反应物进行以下反 应：一个循环的95°C下lmin，以及35个循环的95°C下15秒、50°C下5秒和60°C下4min。 所完成的反应物是通过伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校（UIUC)核心DNA测序设备处理，对 所获得的色谱图进行肉眼检查并用SeqEd程序（AppliedBiosystems)进行编辑。
[0144] 为了评估猪肺泡巨噬细胞对PRRS病毒的干扰素α应答，在包含〇. 5ml RPMI-1640的12X75mm聚苯乙烯圆底管（BDFalcon,Bedford,ΜΑ)中制备猪肺泡巨噬 细胞细胞系ZMAC的培养物（每管2. 5Χ105细胞），所述RPMI-1640含有L-谷氨酰胺和 HEPES(Mediatec，Herndon，VA)并补充了10%胎牛血清（G丨BCO?,Invitrogen，Grand Island,NY)、lmM丙酮酸钠（Mediatec)和IX非必需氨基酸（Mediatech)。将每种培养物与 缺乏（模拟处理）或包含以下PRRS病毒毒株中的一种的0.lml培养基混合：89-46448-40、 G16X、111698、794A61、FL-12或NADC-20,确定所述毒株的浓度可提供0. 04至5的感染复数 (Μ0Ι)。将所述培养物放置在37°C下5% 0)2气氛中，8小时后收集，在4°C下以2000rpm离 心lOmin。除去得到的无细胞上清培养基，并通过使用特异性ELISA检测干扰素α的存在。
[0145] 为了评估PRRS病毒对于巨噬细胞的针对多聚肌苷酸：多聚胞苷酸[多聚 (I:c)]的干扰素α应答的影响，将包含〇.5ml补充的RPMI-1640培养基的圆底管中的 2. 5X105ZMAC细胞的各个培养物与缺乏（模拟处理）或包含以下PRRS病毒毒株中的一种 的培养基混合：89-46448-40、G16X、111698、794A61、FL-12或NADC-20,确定所述毒株的浓 度可提供的Μ0Ι为5。在37°C下5%C02的气氛中孵育2h后，将细胞培养物暴露于10μg/ ml多聚（I:C)(AmershamPharmaciaBiotech,Inc.Piscataway，NJ)并将其重新放回 37°C 下5%C02的气氛环境中。再过8h后，收集培养物，在4°C以2000rpm离心10min。移出得 到的无细胞上清培养基，并通过使用特异性ELISA检测干扰素α的存在。
[0146] 结果表示为在仅用多聚（I:C)刺激的ZMAC细胞培养物中检测到的IFNa量的百 分数，给定所述IFNα的量为1〇〇%的值。在多聚（I:C)处理的ZMAC细胞培养物的上清液 中检测到的IFNa量在该细胞浓度下为ll-35ng/ml。图6中所示数据代表至少三个独立实 验的平均值（土SEM)。
[0147] 如下进行通过使用特异性ELISA的猪干扰素α的定量。在4°C下用50μ1溶于 0. 1Μ碳酸盐缓冲液（pH9. 6)中的 5μg/ml抗猪干扰素amAbF17(PBLInterferonSourc 6，？丨8〇3七3￥37，即，1134)包被灿11(3 11111]1111〇111196孔板的各个孔，持续1611，用含有0.05% Tween20 的PBS(PBS-T)冲洗 3 次，然后在 25°C下用 200μ1 乳封闭液（BioFix,Owings Mi11s，MD，USA)孵育lh。用PBS-T冲洗三次之后，将在RPMI完全培养基中稀释的50μ1细 胞培养物上清液或重组猪干扰素α标准品（PBLInterferonSource)加入到两个孔中并在 25°C下放置1. 5h。用PBS-T冲洗5次后，在25°C下用50μ1包含0. 3μg/ml生物素标记 的抗猪干扰素amAbK9(PBLInterferonSource)和0.5%乳封闭液的PBS-T孵育每个孔， 持续1. 5h。用PBS-T冲洗5次之后，在25°C下用50μ1包含20ng/ml与辣根过氧化物酶 缀合的链霉亲和素（BI0S0URCE?，Invitrogen)的PBS-T孵育每个孔，持续20min，然后再用 PBS-T冲洗 5 次。在 25°C下向每个孔添加 100μ1TMB底物（KPL,Gaithersburg,MD,USA) 开始显色，并用1〇〇μ1 1M磷酸终止反应。用SPECTRAMAXPlus酶标仪（platereader) (MolecularDevices,Sunnyvale,CA)在450nm下测定光密度。计算结果的平均值并通过与 标准曲线进行比较来确定干扰素α的量，所述标准曲线是由使用已知量的该细胞因子而 获得的值产生的。
[0148] 结果。测定了PRRS病毒89-46448-40与三种衍生毒株794Α61、111698和G16X的 蛋白之间的氨基酸差异。包含三种PRRS病毒毒株（794A6U111698和G16X;表3-5)的99% 以上的全部基因组的核苷酸序列一一其对应于导致衍生自89-46448-40病毒分离株的这三 种PRRS病毒毒株（还参见表1_2和图4A-4D)中每一种的表达蛋白的病毒基因组翻译部 分一一的对比揭示出各核苷酸序列之间24个单核苷酸差异。此外，794A61病毒在Nsp2基 因中具有独特的111个核苷酸缺失（第674-710位氨基酸）。在影响氨基酸序列的13个 单核苷酸置换中，7个导致89-46448-40病毒原液基因组中不存在的氨基酸改变。使这三 种病毒与其祖先89-46448-40分离株区分开的7个氨基酸分布于Nsp2、蛋白E、GP3和GP4 的部分（在图4A-4D中以粗体字母指出）中。此外，对于亲代89-46448-40病毒原液，分析 表明，根据在基因组序列色谱图中三个相关位置出现双峰，预测Nsp2的第67和490位氨基 酸，以及GP3的第96位氨基酸（在图4A和4C中以加框字母指出）可能是多态性的。因 此，在NVSL制备的初始的89-46448-40原液（89-46448-40MA104/2)似乎由异源的但密切 相关的病毒种群组成。在这点上，已知PRRS病毒作为相关病毒基因型的准种分布存在。因 此，89-46448-40MA104/2病毒原液内这种有限的多样性与在未纯化的PRRS病毒原液中通 常所观察到的情况一致。相比之下，在794A61、111698和G16X病毒的基因组测序过程中未 观察到具有这类与核苷酸同一性相关的模糊性（ambiguity)，因此表明它们基因组的同质 性。对所述三种纯化的病毒毒株的基因组同质性的其他证明是，在89-46448-40病毒原液 中观察到的每个多态性位点处两个可替代的氨基酸（图4中的加框字母）中仅有一个被预 测存在于它们各自基于病毒基因组序列的蛋白中（在图4中以斜体字母表示），所述病毒 基因组序列在各病毒基因组序列色谱图中的相对位置表现出单一清晰的峰。要重点注意的 是，7个氨基酸改变中的一些是所述衍生病毒之一独有的。例如，111698毒株分别在Nsp2、 GP3和GP4的第338、213和32位具有独特的氨基酸。此外，G16X毒株在蛋白E的第31和 60位氨基酸是独特的（图4B)。值得注意的是，对于全部三种PRRSV毒株794A6U111698 和G16X，GP3中第94位氨基酸的突变是共同的。
[0149] 不希望局限于任何具体的理论，认为蛋白E中第60位编码丙氨酸而非苏氨酸的突 变单独地或与蛋白E中第31位异亮氨酸到缬氨酸的改变结合导致或促成G16X分离株的有 利的免疫表型，所述结合进一步促成了这一表型。应当了解，图4A-4D中所示的其他改变的 氨基酸也促成了G16X分离株的所述表型。
[0150] 测定PRRS病毒89-46448-40和三种衍生毒株对猪肺泡巨噬细胞产生干扰素α 的影响。之前的研究表明，当暴露于PRRS病毒时，猪肺泡巨噬细胞产生非常低到可忽略的 量的干扰素α，不同的PRRS病毒野外分离株所引发的应答之间有一些微小变化。为了确 定亲代89-46448-40分离株与其三种衍生毒株之间的差异，研究了猪肺泡巨噬细胞细胞 系ZMAC对其暴露于所述四种相关病毒的任一种的干扰素α应答。为了进行对比，还研究 了由两种野生型PRRS病毒分离株NADC-20和FL-12刺激的干扰素α应答。ZMAC细胞暴 露于89-46448-40、FL-12或NADC-20病毒分离株导致少量干扰素α应答，其程度类似于 由其他野生型PRRS病毒分离株刺激的来自猪肺泡巨噬细胞的应答。相比之下，肺泡巨噬 细胞暴露于所检测的最高感染复数（ΜΟΙ) (Μ0Ι= 5)的G16X毒株时所引发的应答量级是 相同Μ0Ι的其祖先分离株（89-46448-40)所引发的应答的二倍（图5)。值得注意的是， 111698或794A61病毒对ZMAC细胞的感染引发了大量干扰素α分泌，分别是对它们的祖先 89-46448-40分离株的应答所释放的量的34或40倍。当所述细胞在暴露于多聚（I:C)之 前暴露于PRRS病毒时，获得了G16X毒株与89-46448-40病毒分离株具有生物学差异的其 他证据，所述多聚（I:C)强烈刺激猪肺泡巨噬细胞产生干扰素a(Lovingetal.，2006)。 ZMAC细胞仅暴露于多聚（I:C)导致产生10-30ng/ml的干扰素α。在用多聚（I:C)刺激 ZMAC细胞之前使其暴露于89-46448-40、NADC-20或FL-12病毒2h，强烈抑制了（>25 % ) ZMAC细胞对多聚（I:C)的干扰素α应答。相比之下，在G16X病毒存在的情况下，响应于多 聚（I:C)刺激的ZMAC细胞的干扰素α分泌不但没有被抑制，还增强了约30% (图6)。
[0151] 总之，所述数据表明，来源于NVSL的89-46448-40病毒分离株的原液 (89-46448-40ΜΑ104/2)是由具有相关基因型的病毒混合物组成。本实施例还表明，所述 三种纯化的PRRS病毒毒株794Α61、111698和G16X与亲代89-46448-40病毒种群的差异在 于若干同义和非同义核苷酸点突变。后一种类型的突变分别导致产生分布于Nsp2和结构 蛋白E、GP3和GP4之中的2、3或5个氨基酸改变，所述氨基酸改变使它们与亲代病毒相区 分。如通过它们刺激猪肺泡巨噬细胞产生干扰素α的独特能力所证明的，这三种毒株还与 祖先89-46448-40病毒具有生物学差异。
[0152] 实施例4
[0153]PRRS病毒疫苗
[0154] 实施例4.本实施例说明了在饲养猪的实验性PRRS呼吸激发模型中PRRS病毒毒 株794A61、111698和G16X的疫苗效力的差异。疫苗效力考虑了可指示免患临床疾病的保 护作用的因素，包括猪生长速度、猪病毒血症的程度和持续时间，以及病毒在猪肺部的存在 情况。在表2中总结所述结果。根据这些参数，将这三种几乎同基因的PRRS病毒毒株针对 相同的异源激发病毒的保护性效力被评价为差（794A61)、中等（111698)或良好（G16X)。
[0155] 表2疫苗激发研究的结果
[0156]
[0157] 关键：+++表示强烈效应；++表示良好效应；+表示中度效应；-表示无效应。 (1)，（2)，（3):当比较所指示的接种组与未接种激发对照组时的统计显著性水平。（1) p<0· 001 ; (2)ρ〈0· 005 ; (3)ρ>0·4(不显著）。
[0158] 材料和方法。在包含完全MEM的75cm2组织培养瓶中制备猿猴细胞系MARC-145的 单层，所述完全MEM是由pH调至7. 2并补充了 5%胎牛血清、0. 15%碳酸氢钠和抗生素的 Eagle's最低必需培养基（MEM)组成。在37°C下5%C02的气氛中孵育包含MARC-145细胞 和10ml培养基的培养瓶。使用超低粘附的组织培养瓶（Corning，Corning，NY)在RPMI-1640 培养基中培养猪肺泡巨噬细胞细胞系ZMAC(ATCC编号PTA-8764)并保持在37°C下5%C02 的气氛中，所述RPMI-1640培养基含有L-谷氨酰胺（Mediatec，Herndon,VA)并补充了 10% 胎牛血清（:|0'11^(:〇@,111￥；[1：1'0区611，6抑11(1181&11(1，附）、11111丙酮酸钠（]\16(11&七6(3)和1\非必需氨基酸（Mediatec)。
[0159] 如本领域中所述，使在本研究中被用作潜在疫苗的三种PRRS病毒分离株 (794A6U111698和G16X)在MARC-145细胞单层中增殖。用lml病毒悬液接种MARC-145细 胞的汇合单层，并在37°C下孵育lh以使病毒吸附。然后除去所述病毒接种物并添加10ml 新鲜的完全MEM。然后在37°C下5% 0)2的气氛中孵育所述细胞培养物，直到观察到细胞病 变效应（在4天内）。一旦所述单层中>75%的细胞表现出细胞病变效应，收集培养瓶中的 内含物，纯化或分为l_2ml等分试样，装到无菌玻璃或塑料小瓶中，并贮存于-80°C直到需 要时。为了产生用于动物接种的病毒原液，使直接来自患病动物血清的被用作激发病毒的 "急性PRRS"病毒分离株NADC-20在ZMAC细胞中传代一次。已证明NADC-20病毒在幼猪中 产生显著的呼吸疾病，总体肺损伤得分范围为30-45 %并产生与在其他有毒力的PRRS病毒 分离株中观察到的程度相似的显著的病毒血症。为了进行动物接种，在补充了 0.05%新生 牛血清的磷酸盐缓冲溶液（Mediatech)(稀释剂）中稀释所述病毒以获得104TCID5Q/ml的 病毒效价。模拟接种物仅由稀释剂组成。
[0160] 用于本研究的所述三种疫苗病毒的来源已在上文中详述。用于接种的这些病 毒的原液是："794原液"的6倍噬菌斑纯化的分离株的第二次传代，所述"794原液"是 89-46448-40MA104/2 (由NVSL提供给伊利诺伊大学VDL的原始89-46448-40分离株）在 MARC-145细胞中的第二次传代（794A61P2) ;"794"原液在MARC-145细胞中的终点稀释 (Μ0Ι= 0. 001)传代（111698);以及获得自病毒的两轮噬菌斑纯化的噬菌斑的第三次传代， 所述病毒是从"794原液"以高Μ0Ι(Μ0Ι= 1.0)在MARC-145细胞中的初次随后传代中获得 (G16XP3)。
[0161] 接种前，在补充了0. 05%新生猪血清的Dulbecco's磷酸盐缓冲溶液 (Mediatech,Manassas,VA)中稀释疫苗和激发病毒原液，以获得分别为104. 1或104. 7 TCID5Q/ml的传染性剂量。在使用当天通过在MARC-145细胞（三种疫苗）或ZMAC细胞 (NADC-20激发病毒）中进行滴定来验证每种接种物的预期效价，如以下所述。
[0162] 为了对用于接种的制品中传染性病毒的量（传染性病毒效价）进行定量，在包 含0. 9ml完全MEM的管中将所述病毒原液连续稀释10倍。将被检测的每种稀释样品的 0.lml等分试样分别转移到96孔组织培养板的四个孔中，所述孔包含覆盖在几乎汇合的 MARC-145细胞单层的0.lml培养基。在37°C下湿润的5%C02的气氛环境中培养5天后， 使用倒置显微镜检查每个孔中的细胞的细胞病变效应的存在。当其中>90%的细胞表现出 细胞凋亡和/或已裂解时，将孔评分为病毒感染阳性。使用Reed和Muench方法（Reedand Muench，1938)来测定每个样品的TCID5。数。
[0163] 为了测定激发病毒制品中传染性病毒的量，在包含0. 9ml的RPMI-1640培养基 (Mediatech)(补充了 5%胎牛血清（Gibco))的管中将NADC-20原液连续稀释10倍。将被 检测的每种稀释样品的〇.lml等分试样分别转移到96孔组织培养板的四个孔中，所述孔包 含0.lml培养基且具有3-4X104ZMAC个细胞/孔。在37°C下湿润的5%C02的气氛环境中 孵育96h后，使用倒置显微镜检查每个孔中的细胞的细胞病变效应的存在。当其中>90%的 细胞表现出细胞凋亡和/或已裂解时，将孔评分为病毒感染阳性。使用Reed和Muench方 法来测定每个样品的tcid5。数。对从感染了病毒或未感染病毒（naive?的各个猪中采集 的每个血清和支气管肺泡灌洗（BAL)液样品进行使用ZMAC细胞的病毒感染力的类似滴定。
[0164] 使用具有数字读数的天平来测量每只猪的体重。在每次使用前和使用后使用校准 重量来对所述天平进行校准。在病毒激发的当天（临接种前）和激发后第7天对全部猪进 行称重。计算每只猪在激发后第7天的体重相对于其各自在NADC-20病毒接种当天体重的 体重增加。将结果表示为每个处理组的平均校准体重改变土均值的标准误差（SEM)。
[0165] 在NADC-20病毒