6、102至 10 5、102至 10 4、103至 10 10、103至 10 9、103至 10 8、 103至 10 7、103至 10 6、103至 10 5、104至 10 10、104至 10 9、104至 10 8、104至 10 7、104至 10 6、105 至1〇10、105至10 9、105至10 8或10 5至10 7个病毒颗粒。
[0085] (5)制剂
[0086] 所述组合物可包括阳离子脂质体、阴离子脂质体、蜗形体（cochleate)或微胶囊。 所述脂质体或蜗形体可增强所述病毒的体内转染。所述脂质体可以是具有水性内部的球形 脂双层。在脂质体形成时存在于水性溶液中的所有分子都可被纳入水性内部中。脂质体内 含物可被保护以避免接触外部环境，并且由于脂质体与细胞膜融合而被高效地递送到细胞 质中。此外，由于某些小的有机分子的疏水性，可直接将其给予到细胞内。所述组合物还可 包括另一种药用试剂、药物试剂或稀释剂。
[0087] 可将所述组合物配制成水溶液、液体溶液或悬液、适用于在注射前成为液体溶液 或悬液的固体形式，或乳剂。为了进行注射，可将所述组合物配制在水性溶液中，所述水 性溶液可以是生理上相容的缓冲液形式，例如汉克斯溶液（Hanks'solution)、林格氏溶液 (Ringer'ssolution)或生理盐水缓冲液。对于经粘膜（transmucosal)给药，在所述制剂 中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。在本领域中此类渗透剂通常是已知的。可用阳离子 脂质或脂质体来配制所述组合物。所配制的用于口服给药的组合物可以是片剂、锭剂、胶囊 或溶液形式，并且可以被配制为用于延迟释放或仅在药物到达小肠或大肠时释放。
[0088] 用于胃肠外给药的组合物可以被配制成水溶形式的水性溶液。所述悬液可被制备 为油性注射悬液。所述悬液可包括适合的亲脂溶剂或载体，其可以是脂肪油例如芝麻油，或 合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。用于水性注射的悬液可包含增加所 述悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。所述悬液还可包含适合的稳定 剂或增加所述组合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。
[0089] 可通过将活性化合物和固体赋形剂结合来获得用于口服的所述组合物。获得所 述组合物还可包括在添加适合的助剂之后研磨所获得的混合物，以及加工颗粒混合物以 获得片剂或锭剂核心。所述固体赋形剂可以是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或 山梨醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪树胶（gum tragacanth)、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。所 述组合物还可包括崩解剂，其可以是交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐（例如海 藻酸钠）。
[0090] 所述组合物可以是锭剂核心，其可具有适合的包衣。所述包衣可包括浓缩的糖溶 液，以及可包括阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆 溶液，或适合的有机溶剂或溶剂混合物。片剂或锭剂可包括含有着色剂或染料的包衣，所述 着色剂或染料可用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
[0091] 所述组合物可被配制成用于口服给药，作为包含明胶的推入式（push-fit)胶囊 形式，或可被配制成包含明胶或增塑剂（例如丙三醇或山梨糖醇）的密封胶囊。所述推入 式胶囊可包括与填充剂（例如乳糖）、粘合剂（例如淀粉）、润滑剂（例如滑石或硬脂酸镁） 或稳定剂混合的所述组合物。用于口服给药的所述组合物可被配制成软胶囊，并且所述组 合物可被溶解或悬浮于适合的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。所述软胶囊 还可包括稳定剂。
[0092] 在组合物包括DNA疫苗的情况下，所述组合物可包括被纳入脂质体或蜗 形体中以增强体内转染的DNA。所述组合物可包括遗传佐剂，所述遗传佐剂可以 是免疫刺激序列（ISS)或编码细胞因子的核酸。所述遗传佐剂可以是如Horner A.A.etal. , 1998,ImmunostimulatoryDNAisapotentmucosaladjuvant,Cell Immunology, 190:77-82中所记载的，所述文献内容以引用的方式纳入本文。
[0093] (6)制备方法
[0094] 可以通过其自身已知的方式来制备所述组合物，例如通过常规的混合法、溶解法、 粒化法、锭剂制备法、悬浮法（levitating)、乳化法、包囊法、包埋法（entrapping)或冷冻 干燥法。
[0095] 3.产生免疫应答的方法
[0096] 本文提供了一种在哺乳动物中产生或诱导免疫应答的方法，所述哺乳动物可以是 猪。所述方法可包括将包括所述病毒的组合物给予需要其的哺乳动物。所述方法还可包括 给予免疫原性组合物，其可以是加强剂（booster)，以及可包括给予本文所述的佐剂。所述 组合物可为所述哺乳动物提供针对PRRS病毒的保护性免疫。与未被给予所述组合物的哺 乳动物相比，所述组合物还可在所述哺乳动物中导致更多的体重增加和更少的病毒血症。 与未被给予所述组合物的哺乳动物相比，所述组合物可在所述哺乳动物中诱导免疫，这可 以有助于在所述哺乳动物中实现更少的流产和/或正常产仔，或减轻呼吸疾病的严重程度 和死亡率。
[0097]a.给药方式
[0098] 可通过任何有效途径给予所述包含病毒的组合物，所述途径可以是全身或局部途 径。所述给药可以是胃肠外、肌肉内、真皮内、皮下、□服、粘膜、舌下、眼内、鼻内、静脉内、腹 膜内、髓内、局部或经皮肤给药。所述给药还可以是直肠、阴道或肠道给药。所述给药可以 是通过注射，其可使用针头和注射器来进行。所述给药还可以是通过电穿孔、阳离子微粒、 超声波分散（ultrasonicdistribution)或通过生物射弹颗粒（biolisticparticle) 〇
[0099] 所述给药还可是基于具有阳离子脂质或脂质体的组合物制剂，所述阳离子脂质 或脂质体适用于细胞因子佐剂的DNA形式或蛋白形式，或适用于化学品（例如能够进行 免疫刺激的化学品，例如通过诱导内源细胞因子）。此类给药的实例记载于Pachuket al.,2000,CurrOpinMolTherApr2 (2):188-98；VanSlootenetal.2001,Biochim BiophysActa1530:134-45；VanSlootenetal. , 2000,PharmRes17:42-48；Lachmanet al·，1996,EurCytokineNetw7:693-8,所述文献内容以引用的方式纳入本文。
[0100] 所述佐剂可被包含在所述包含病毒的组合物中。还可在给予所述包含病毒的组合 物同时给予所述佐剂，或在给予所述包含病毒的组合物的1、2、4、8、12、18或24小时之内给 予所述佐剂。
[0101] b.给药时间
[0102] 可在所述哺乳动物为约2周龄到约30周龄时或在所述哺乳动物成年时，将所述组 合物给予所述哺乳动物。还可在初次给药后约2周到约5周时第二次给予所述组合物，还 可再给予数次。还可将所述组合物给予交配的雄性或雌性，可在交配前或产仔后给予所述 组合物。
[0103] 可由各临床医生或鉴于患者的状况来选择用于产生免疫应答的准确制 剂、给药途径和剂量，例如Finglet.al.，inThePharmacologicalBasisof Therapeutics, 1975,Ch. 1p. 1中所描述的，所述文献内容以引用的方式纳入本文。主治兽 医或医生应了解如何及何时因毒性或因器官功能障碍或其他负作用而终止、中断或调整给 药。相反，如果临床反应不充分（排除毒性），主治医生也知道将治疗调整到更高的水平。 在目的疾病的处理中给药剂量的大小可随待治疗的病症的严重程度和给药途径而变化。例 如，可通过标准预后评估方法对病症的严重程度进行部分评估。此外，剂量和可能的剂量频 率也可根据各个患者的年龄、体重和反应而变化。与以上所述的程序相当的程序也可用于 兽医学中。
[0104] 本发明具有多个方面，其可通过以下非限制性实例来举例说明。
[0105] 实施例
[0106] 实施例1
[0107]PRRS疫苗组分
[0108] 实施例1.本实施例示出了本文所述的疫苗的具体实例。具体而言，本实施例描 述了三种名为794A61、111698和G16X的分离并纯化、几乎同基因的猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS)病毒，每种病毒均衍生自天然表现出可忽略的毒力的原始北美PRRS病毒分离株 89-46448-40的原液。所述起源的89-46448-40病毒原液包含遗传上相关的PRRS病毒变体 的混合种群，使用标准噬菌斑测定或终点稀释从所述混合种群将所述三种毒株纯化至同质 (homogeneity)。对所述三种毒株的基因组序列分析揭不出，它们与存在于89-46448-40病 毒原液中的病毒基因型的差异在于若干同义和非同义点突变。后一类型的核苷酸突变导致 三种结构病毒蛋白和一种非结构病毒蛋白具有亲代病毒种群中不存在的新的氨基酸改变。 所述三种分离的毒株与亲代病毒89-46448-40的生物学差异还在于，它们刺激病毒感染的 猪肺泡巨噬细胞的相当强的干扰素α应答的能力。此外，与亲代89-46448-40不同的是， G16X毒株不抑制暴露于多聚（I:C)的猪肺泡巨噬细胞的干扰素α合成，而是增强它们对 此激活分子的应答。值得注意的是，尽管这三种毒株几乎是同基因的，它们在其疫苗潜能方 面彼此之间差异显著，如随后用遗传上不同的（异源的）PRRS病毒分离株进行激发后它们 在提供保护方面的疫苗效力的程度（差，794A61 ;中等，111698 ;以及良好，G16X)所证明的。 一种疫苗分离株（G16X)本身与其他两种分离株（794A61和111698)的区别在于，它在为经 免疫的猪提供更大保护的能力方面胜出，如从组织中更快减少和/或清除有毒力的激发病 毒时所证明的。
[0109] 通过噬菌斑纯化（794A61和G16X)或通过终点稀释（111698)从PRRS病毒 89-46448-40的低传代原液获得所述三种PRRSV毒株（G16X、794A61和111698)。在爱荷华 州埃姆斯（Ames)的国家兽医服务实验室（NVSL)，从作为诊断例（被指定为89-46448)被 提交的动物的样本中分离所述89-46448-40病毒，所述诊断例来自在1989年经历了PRRS 爆发的爱荷华农场（Wesleyetal，1998)。值得注意的是，所述89-46448诊断例代表最 早公开记录的从中回收PRRS病毒的PRRS爆发之一（Wesleyetal. ,1998)。因此，所述 89-46448-40病毒可能代表在美国分离的时间上最古老的PRRS病毒之一。在NVSL的病毒分 离是通过用从被感染的动物制备的浸渍组织的澄清悬液覆盖MA-104非洲绿猴细胞系的单 层细胞完成的。通过所述细胞培养物接种后6-8天之内的细胞病变效应的发生来指示病毒 分离，如Kim等人所描述（1993，"Enhancedreplicationofporcinereproductiveand respiratorysyndrome(PRRS)virusinahomogeneoussubpopulationofMA-104cell line，"Arch.Virol. 133, 477-83)。在接种后第10天时收集培养液，并贮存于-70°C。随后在 NVSL使用Kim等人（1993)所描述的方法在MA-104细胞中进行89-46448-40病毒分离株的 传代。在1992年年末至1993年年初，NVSL将若干PRRS病毒分离株（包括89-46448-40分 离株）的等分试样作为参考PRRS病毒分发给美国的若干兽医诊断实验室（VDL)。伊利诺伊 大学的VDL(Urbana，IL)收到了含有约lml培养基的小瓶，所述培养基收集自89-46448-40 分离株在MA-104细胞中的第二次传代（89-46448-40MA104/2)，所述89-46448-40分离 株来自从中分离出它的样品。在伊利诺伊大学VDL，将MARC-145细胞系--源自MA-104 细胞的受纳PRRS病毒的细胞克隆--用作宿主，以从89-46448-40MA104/2等分试样制 备89-46448-40病毒原液。使用本领域中已知的方法使所述病毒增殖，并且使用在包含 Eagle's最低必需培养基（MEM)的75cm2组织培养瓶中培养的MARC-145细胞的单层，所述 培养基的pH被调至7.2,并且已向其中添加5%胎牛血清、0. 15%碳酸氢钠和抗生素（完全 MEM)。将含有MARC-145细胞和10ml培养基的培养瓶在37°C下在5 % 0)2的气氛中孵育数 天，直到建立汇合的细胞单层。这时，用lml稀释的病毒悬液接种细胞单层，并且在37°C下 孵育lh以使病毒吸附。然后除去所述接种物并添加10ml新鲜的完全MEM。然后在37°C下 在5% 0)2的气氛中孵育所述细胞培养物，直到观察到细胞病变效应（该效应在4天内发 生）。一旦单层细胞中>75 %的细胞表现出细胞病变效应，收集培养瓶的内含物，合并到单 个容器中，在无菌玻璃小瓶中分为l_2ml等分试样并贮存于-80°C下直到需要时。通过使用 标准技术和MARC-145细胞来测定所述病毒原液的效价（参见实施例1，材料和方法）。例 如，在1994年7月制备的原液（"794原液"）的效价为l(f4TCID5。并对应于在伊利诺伊大 学VDL的PRRS病毒分离株89-46448-40在MARC-145细胞中的第二次传代，即该病毒在所 培养的细胞中的第四次总传代，包括其在MA-104细胞中的分离。
[0110] 从所述"794原液"PRRS病毒中直接分尚所述111698和794A61病毒毒株。为了 产生111698病毒，将1. 0ml"794原液"的3000倍稀释物（Μ0Ι= 0. 001)用作接种物，以 感染75cm2组织培养瓶中的MARC-145细胞的单层（一式三份）。在37°C下在潮湿的5% 〇)2的气氛中4天之后，当三个单层中的每一个的>75 %表现出细胞病变效应时，收集培养 瓶的内含物。将合并的收集物在4°C下以2000rpm离心10min以除去细胞碎片，将指定为 111698病毒的上清液分成等分试样并贮存于-80°C。与此不同，所述794A61病毒是"794 原液"的6倍噬菌斑纯化的产物。首先，用MEM(pH7. 2)中的"794"原液的连续10倍稀释 物覆盖直径为35mm的组织培养皿中的MARC-145细胞单层，所述MEM补充了 10 %胎牛血清 和50μg/ml庆大霉素。在室温下振荡lh后，除去接种物并用3ml2XMEM的1:1混合物覆 盖所述单层，所述MEM补充了 6%胎牛血清、100μg/ml庆大霉素和2%低熔点琼脂糖。在 室温下30min后（以使琼脂糖变硬），将平板放置在37°C下湿润的5% 0)2的气氛中4天。 此时为了增强噬菌斑的可视性，在每个琼脂糖覆盖层的上方放置100μ1的l〇〇mg/ml噻唑 蓝溴化四唑（甲基噻唑二苯基-溴化四唑，MTT)，并在噬菌斑以具有黑暗边界的清晰区域形 式出现之前，将细胞放回37°C下湿润的5%C02的气氛环境中2-3h。使用巴斯德移液管挑 取以接种物的最大稀释物成功感染的那些单层中的若干明显分离的噬菌斑，并将其转移到 包含0.5mlMEM的小瓶中，所述MEM补充了 10%胎牛血清和50μg/ml庆大霉素。在将所选 择的噬菌斑之一用作接种物之前，在-80°C下对其进行两轮冷冻。再重复5次这一噬菌斑 纯化过程，将第6轮之后挑取的噬菌斑指定为794A61。在-80°C下进行两轮冷冻之后，使用 0.lml所述794A61制品来感染直径为35mm的组织培养平板，如以上所述。但是，在该情况 下，用3ml补充了 3%胎牛血清和50μg/ml庆大霉素的MEM覆盖单层。在37°C下湿润5% C02的气氛环境中3天之后，约20%被感染的单层表现出细胞病变效应。此时，收集培养基， 在4°C下以2000rpm离心lOmin以除去细胞碎片，将上清液指定为794A61P1病毒并贮存 于-80°C。如上所述，在75cm2组织培养瓶中的MARC-145单层细胞中对该病毒进行再次传 代（MOI= 0· 01)以产生 794A61P2 病毒。
[0111]G16X病毒的分尚间接从"794原液"病毒开始，其中接种物来源是"794原液"病 毒在75cm2培养瓶中的MARC-145细胞单层中的连续传代。在这种情况下，用lml未稀释的 "794原液"感染每个单层（MOI= 1)。在37°C下湿润的5%C02气氛中3天之后，当三个单 层中的每个的>90%均表现出细胞病变效应时，收集培养瓶的内含物。将合并的收集物在 4°C下以2000rpm离心lOmin以除去细胞碎片，将上清液指定为VR病毒，分成等分试样并贮 存于-80°C。如上所述，对该VR病毒制品进行5倍噬菌斑纯化，除了在感染后4-5天之外， 将各个噬菌斑被鉴定为在相对清晰的未感染细胞单层背景下的不透明区域。在以上所述 条件下，在直径为35_的组织培养皿中对来自所述第5次噬菌斑纯化的分离的噬菌斑进行 传代，其是以不同的MOI在25或75cm2组织培养瓶中对MARC-145细胞的此次感染和随后 四次感染的后代。将来自病毒的第5次未经选择的传代的上清液培养基作为初始接种物， 用于如上所述的使用MTT进行噬菌斑可视化的第6轮噬菌斑纯化。将第6轮之后所挑取 的明显分离的噬菌斑指定为G16X，如上所述，首先使其在直径为35mm的组织培养平板中的 MARC-145细胞单层中增殖（G16XP1)，然后在cm2培养瓶中连续增殖两次（G16XP2和G16X P3)以产生所述794A61病毒。
[0112] 已有记载表明，PRRS病毒分离株的致病性水平差异相当大。此外，显而易见的是， 在1987-1988年的PRRS的北美首次爆发后的25年中，美国和世界其他地区的PRRS病毒的 毒力水平已上升到令人担忧的程度。PRRS病毒毒力的第一次显著上升发生在1996年，当时 猪的兽医和诊断医生开始报道疾病爆发，所述疾病爆发被描述为"猪流产与死亡综合征"、 "非典型PRRS"或"急性PRRS"。这在实验研究中被确认，所述研究表明，不但20世纪80年 代后期的PRRS流行开始时在美国猪群中传播的毒株的毒力小于1996年夏天出现的那些毒 株的毒力，而且后者导致更高严重程度的PRRS爆发。但是，即使是在20世纪90年代早期， PRRS爆发的不同疾病严重程度也是显而易见的。尽管主要是10周龄以下的猪患上强度范 围从中度到严重的呼吸疾病而未出现繁殖障碍，但是也观察到在更大的猪中爆发严重呼吸 疾病并表现出繁殖障碍，主要是怀孕母猪的晚期流产。为了试图区分PRRS病毒毒力的不 同水平，开发了呼吸致病性的具体测量方法。其包括对受到明显可见的肺炎影响的肺部的 百分数进行评分，所述明显可见的肺炎是由用被报道表现出不同毒力水平的PRRS病毒的9 种不同分离株之一实验性感染幼猪所引起的。这种方法使得能够将1993年或更早获得的 PRRS病毒分成高和低毒力分离株。但是，使用这种评分方法获得了不一致的结果，并且不 同的疾病特征被用于评估毒力。在这种情况下，根据被感染的猪肺部的总体病理学（gross pathology)，两种分离株的毒力水平（之前被分为高（VR-2385)或低（VR-2431))与对所述 病毒诱导晚期生殖障碍的能力的方面进行评估时所得的毒力水平相似。
[0113] -种用来测定PRRS病毒毒力的更可靠和更常用的参数是监测被感染的猪的血流 中传染性病毒的量（病毒血症）。例如，用被归类为表现出中等或尚水平毒力的PRRS病毒 分离株接种幼猪可重复地产生高水平病毒血症，所述病毒血症在病毒接种后3天内发生并 可持续28天以上。相反，给予等价剂量的减毒（疫苗）PRRS病毒毒株一一其是通过在猿 猴细胞中连续传代由有毒力的菌株获得一一产生显著更低水平的病毒血症，尽管具有相似 的（>28天）持续时间。值得注意的是，由PRRS病毒感染所引起的病毒血症与猪生长负相 关，并且与临床疾病的严重程度正相关。缺乏食欲也是PRRS病毒感染的一个标志，在年幼 的和快速生长的猪中感染负面影响其体重增加速度和饲养效率。同样，感染中度或高毒力 的PRRS病毒分离株强烈降低生长中的猪的体重增加速度。另一方面，用减毒的PRRS病毒 毒株接种猪会最小程度或完全不减少猪的生长。因此，尽管有毒力的PRRS病毒显著抑制幼 猪的生长速度并产生强烈的病毒血症，但是通过在细胞培养物中连续传代而使得不具备毒 力（减毒）的PRRS病毒毒株不影响幼猪生长并产生相对较弱的病毒血症。
[0114] 实施例2
[0115]PRRS病毒的分离
[0116] 实施例2.本实施例说明突变的PRRS病毒的分离。PRRS病毒分离株89-46448-40 天然表现出可忽略的毒力水平，其类似于（如果不低于的话）所描述的通过体外连续传代 产生的PRRS病毒减毒毒株的毒力水平。通过评估之前被用来测定PRRS病毒毒力的参数， 来测定PRRS病毒分离株89-46448-40所具有的毒力水平，所述参数包括被病毒感染的猪的 体重增加、被病毒感染的猪中病毒血症的程度和时间长短，以及被病毒感染的猪的