CCTG-3'
[0032] 所述如SEQIDN0:3所示的下游引物具体为：
[0033] 5' -AGATCCAGTTTATCGATTACCACATTTGTAGAGGTTTTAC~3,
[0034] 该上游引物和下游引物中的非下划线部分分别与萤火虫荧光素酶编码基因的两 端特异性互补，该上游引物和下游引物中的下划线部分分别与PLVX-IRES-ZsGreenl病毒 表达载体Clal酶切位点处的序列特异性互补；采用该对引物进行PCR得到的萤火虫荧光素 酶编码基因产物可采用In-Fusion重组方法克隆到pLVX-IRES-ZsGreenl的Clal酶切位点 中。
[0035] 优选地，采用Takara公司提供的In-Fusion克隆试剂盒将PCR得到的萤火虫荧光 素酶编码基因克隆到pLVX-IRES-ZsGreenl的Clal酶切位点中。
[0036] 第五方面，本发明提供了如第一方面所述的重组慢病毒载体在分析启动子和/或 增强子的功能或调控作用中的应用。
[0037] 优选地，如第一方面所述的重组慢病毒载体在分析启动子的功能或调控作用中的 应用。
[0038] 优选地，如第一方面所述的重组慢病毒载体在分析增强子的功能或调控作用中的 应用。
[0039] 优选地，如第一方面所述的重组慢病毒载体在分析启动子和增强子的功能或调控 作用中的应用。
[0040] 优选地，所述启动子和/或增强子的功能或调控作用为启动子和/或增强子的转 录活性。
[0041] 此外，本发明提供的重组慢病毒载体以及宿主细胞可用于研究包括原代细胞、分 裂以及非分裂细胞、干细胞、末端分化细胞和神经元细胞等的多种细胞类型中启动子和/ 或增强子对报告基因的转录调控作用。
[0042] 本发明提供了的重组慢病毒载体及其制备方法和应用具有如下有益效果：
[0043] (1)本发明提供的重组慢病毒载体具有ZsGreenl和萤火虫荧光素酶双荧光标记， 适用于分析启动子和/或增强子的功能或调控作用，尤其适用于分析启动子和/或增强子 的转录活性；
[0044] (2)本发明提供的重组慢病毒载体对细胞的毒性小；
[0045] (3)本发明提供的重组慢病毒载体的制备方法简便，易于工业化生产。
【附图说明】
[0046] 图1为本发明实施例扩增的萤火虫荧光素酶编码基因的琼脂糖凝胶电泳图；
[0047] 图2为本发明实施例提供的样品酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；
[0048] 图3为本发明实施例制备的重组质粒经PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；
[0049] 图4为本发明实施例制得的重组载体的质粒图谱。
【具体实施方式】
[0050] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0051] 下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： ((Molecular Cloning:A Laboratory ManualKSambrook, J.,Russell, Davidff.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所用引物及 DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。
[0052] 本发明实施例所使用的pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体购自Clontech，含 pGL4. 10[luc2]质粒菌种购自promega，所使用的DH5a为市售商品，所使用的试剂均为市 售商品。
[0053] 本发明实施例提供了一种重组慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
[0054] (1)萤火虫突光素酶基因的克隆
[0055] a)提供上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的碱基序列如SEQIDN0:2所 示，所述下游引物的碱基序列如SEQIDNO:3所示；
[0056] b)按照TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer. 4. 0 (宝生物工程（大 连）有限公司）试剂盒说明书中的步骤提取pGL4. 10[luc2]质粒，用Nanodrop2000c测定其 浓度为463ng/yl，将该pGL4. 10 [luc2]质粒作为DNA模板，采用PCR扩增luc基因，配置扩 增体系如下，体系中的引物采用步骤（1)所述的上游引物和下游引物：
[0057]PCR反应体系
【主权项】
1. 一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体是在pLVX-IRES-ZsGreenl 慢病毒载体的第2180bp处插入了萤火虫荧光素酶编码基因序列。
2. 如权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述萤火虫荧光素酶编码基因 序列是核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的DNA分子。
3. 如权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病 毒载体的第2180bp处还插入有待分析的启动子和/或调控目标蛋白的调控序列，所述待分 析的启动子和/或调控目标蛋白的调控序列插入在所述萤火虫荧光素酶编码基因序列的 上游。
4. 如权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述萤火虫荧光素酶编码基因 序列插入在pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的Clal酶切位点。
5. -种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求1所述的重组慢病毒载 体。
6. 如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为Jurkat细胞。
7. -种如权利要求1所述的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 、提供或制备萤火虫荧光素酶编码基因的上游引物和下游引物，及萤火虫荧光素酶 编码基因的模板，然后采用PCR扩增萤火虫荧光素酶编码基因； (2) 、取pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体，将步骤（1)扩增得到的萤火虫荧光素酶编码 基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的第2180bp处，得到所述重组慢病毒载 体。
8. 如权利要求1所述的一种重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于， 所述步骤（1)中，所述上游引物和下游引物的碱基序列分别如SEQIDN0:2和SEQID NO:3所示；所述萤火虫荧光素酶编码基因的模板为含有萤火虫荧光素酶编码基因序列的 重组载体PGL4. 10 ; 所述步骤（2)中，为采用In-fusion重组的方法将步骤（1)扩增得到的萤火虫荧光素酶 编码基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的第2180bp处。
9. 如权利要求8所述的一种重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2) 中，将步骤（1)扩增得到的萤火虫荧光素酶编码基因克隆到所述pLVX-IRES-ZsGreenl慢病 毒载体的Clal酶切位点。
10. 如权利要求1所述的重组慢病毒载体在分析启动子和/或增强子的功能或调控作 用中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体是在pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的第2180bp处插入了萤火虫荧光素酶编码基因序列。本发明还涉及含上述载体的宿主细胞、上述载体的构建方法及其在分析哺乳动物细胞启动子和/或增强子的功能或调控作用中的用途。本发明为寻找、分析、应用调控目标蛋白表达量或表达水平的启动子和/或增强子提供了一种快速、高效、直观、简单易行的方法。
【IPC分类】C12N15-66, C12N15-867, C12N5-10, C12Q1-68
【公开号】CN104711293
【申请号】CN201310693741
【发明人】万晓春, 阮庆国, 王绍文
【申请人】深圳先进技术研究院
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月16日