膜表达人pd-1蛋白的稳转株细胞构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及膜表达人ro-1蛋白的稳转株细胞构建方法。
【背景技术】
[0002] 程序性细胞死亡蛋白1(Programmedcelldeathproteinl，以下简称ro-l)是 由H)CD1基因也叫CD279基因编码的蛋白，为免疫球蛋白超家族中的细胞膜蛋白成员之一， 是典型的由268个氨基酸组成的I型膜蛋白。H)-l是⑶28/CTLA4家族中的T细胞调节因 子之一，其结构包括一个胞外的IgV结构域，其后紧跟着一个跨膜结构域和一个胞内末端。 PD1最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死 亡-1受体。pd-li与其t细胞上的受体ro-i相互作用，在免疫应答负调控方面发挥着重要 作用，该分子具有广泛的组织表达谱，在一些肿瘤细胞系上有较高的表达，许多研究均表明 其于肿瘤的免疫逃逸机制相关。肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的ro-Li的表达，且 广范表达，表达的ro-Ll有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡。因此通过阻 断ro-Li/ro-i信号通路可有效抑制肿瘤生长，可根据此设计新的对肿瘤免疫逃逸的治疗 方案，来加强T细胞对肿瘤的杀伤作用。
[0003] 在抗肿瘤免疫中，通常遵循肿瘤特异性T细胞活化、T细胞增值、肿瘤浸润和T细 胞记忆应答加强的步骤。研究表明，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的apcs表达的ro-Li均可 经ro-1/PD-Ll信号通路抑制肿瘤抗原特异性T细胞的活化，下调T细胞介导的肿瘤免疫应 答，干预ro-1/PD-Ll信号有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。
[0004] 目前，构建稳定表达细胞系有两种方法：
[0005] 1)抗生素筛选：该种方法的构建稳定表达细胞系的基本原理是将外源DNA克隆 到具有某种抗性的载体上，将目标基因构建至带有抗生素筛选标记的质粒上，载体在通 过磷酸钙转染、脂质体转染或者电转等方式转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用 载体所含的抗生素标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素 (neomycin)、潮霉素（hygromycin)和噪呤霉素（puromycin)，用长G418来代替新霉素进行 选择性筛选，筛选得到可稳定表达的目的蛋白的细胞株。但其筛选时间长，且受限于所采用 的转染方式和相应的细胞系，对于某些不能转染长期培养的原代细胞和难转染的细胞将不 适合采用这种方法，且转然效率的高低直接影响整合发生的概率，而且假阳性发生率高，细 胞在长期的抗生素培养基中容易产生抗药性，后续细胞筛选鉴定工作量大。
[0006] 2)慢病毒感染后筛选：慢病毒（Lentivirus)载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型 病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分 裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体带有可进行高效率的包装、转染并稳定整合进靶细胞 的基因组中的序列元件，目的基因参与细胞的基因重组，形成稳定遗传物质，使得目的基因 在细胞中可稳定长期表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、 肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。慢病毒 感染细胞后能很快将目的基因随机整合至基因组中，整合效率高，假阳性少等优点。且其筛 选标记物可扩展到各类荧光蛋白标记的非抗生素标记物，如EGFP，RFP，YFP，ZsGreenl等， 在后续的筛选中可轻易通过流式细胞仪进行识别和筛选，无需加入流式抗体。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种膜表达人ro-i蛋白的稳转株细胞构建方法，旨在解 决现有技术单克隆抗体生产株假阳性发生率高、亲和力不高、单克隆筛选时间长和筛选成 本高的问题。
[0008] 本发明是这样实现的，一种膜表达人ro-i蛋白的稳转株细胞构建方法，包括如下 步骤：
[0009] 设计含酶切位点EcoRI的引物pLVX-PD-1-F和含酶切位点BamHI的引物 pLVX-PD-1-R，并所述药物与ro-1的DNA序列进行PCR扩增，收集扩增产物；
[0010] 将慢病毒包装质粒载体pLVX-IRES-ZsGreenl与所述扩增产物分别进行酶切处 理，分别得到pLVX-IRES-ZsGreenl(EcoRI+BamHI)和PD-1 (EcoRI+BamHI)酶切产物；所述 pLVX-IRES-ZsGreenl(EcoRI+BamHI)和PD-1 (EcoRI+BamHI)酶切产物连接后转化处理，将 转化产物扩增后进行质粒抽提处理，得到膜表达H)-l的载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl;
[0011] 将所述膜表达PD-1的载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl与病毒包装质粒pMD2. G和 PsPAX2共转染至真核细胞中，进行病毒包装，同时对病毒滴度进行监控；
[0012] 当病毒滴度以M0I=2-10感染所述真核细胞时，加入终浓度为5-8ug/ml的 polybrene协助病毒；将感染病毒的所述真核细胞进行正常传代后，选取荧光阳性细胞进 行分选，并对分选的细胞进行扩增后冻存处理，得到稳定表达ro-i的细胞株。本发明提供 的膜表达人ro-i蛋白的稳转株细胞构建方法，通过包装慢病毒再感染真核细胞，经荧光筛 选后得到可稳定表达ro-1抗原的细胞株。由于该方法中将包装的慢病毒进一步的感染了 真核细胞，使得其能在单抗研发过程中通过结合表面表达的抗原快速筛选到亲和力高的 ro-1细胞株；且采用自带荧光蛋白ZsGreen的载体进而稳转株的构建，使得在ro-1细胞株 的筛选过程变得更为简单方便，大量的节约单克隆筛选时间和筛选成本。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明实施例膜表达人ro-1蛋白的稳转株细胞构建方法流程图；
[0014] 图2本发明实施例提供的ro-1的DNA的PCR扩增产物电泳图，其中，M表示 Marker，"一"表示阴性对照，1-2为ro-1的DNA的PCR产物；
[0015] 图3是本发明实施例提供的pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl载体构建酶切鉴定电泳 图，其中，M表示Marker; 1-4 为pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl单克隆EcoRI+BamHI双酶切；
[0016] 图4是本发明实施例提供的蛋白表达鉴定中的质粒转染细胞荧光图；
[0017] 图5是本发明实施例提供的WesternBlot蛋白表达图，其中，1为293T细胞胞液， 2为293T细胞膜抽提液，3为ZsGreen细胞胞液；4为ZsGreen细胞膜抽提液，5为H)-l细 胞胞液；6为ro-i细胞膜抽提液；
[0018] 图6是本发明实施例提供的病毒包装时细胞转染荧光图；
[0019] 图7是本发明实施例提供的病毒滴度测定时的病毒感染荧光图，其中，a为5iU病 毒感染英冠图，b为0. 5ii1病毒感染突光图；
[0020]图8是本发明实施例提供的毒滴度分析流式图，其中，a为5iU病毒感染孔的毒 滴度分析流式图，b为0. 5ii1病毒感染孔的毒滴度分析流式图；
[0021]图9是本发明实施例提供的稳转株细胞构建时的病毒感染荧光图；
[0022] 图10是本发明实施例提供的稳定表达细胞株分选流式图。
【具体实施方式】
[0023] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用 以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024] 本发明实施例提供了一种膜表达人ro-i蛋白的稳转株细胞构建方法，包括如下 步骤，如图1所示：
[0025] S01?构建载体pLVX-PD-1-IRES-ZsGreenl :设计含酶切位点EcoRI的引物 pLVX-PD-1-F和含酶切位点BamHI的引物pLVX-PD-1-R，并所述药物