基于蛋白质的药理活性物质组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物输送系统，尤其涉及药理活性物质输送系统，特别涉及基于蛋白质的药理活性物质组合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]静脉内药物输送可迅速、直接地与携带药物到身体其余部位的血流达到平衡。为了避免注射后短时间血管内出现药物峰值浓度，将药物携带于稳定载体内，可在冲击剂量静脉注射后使药物在血管内逐渐释放。
[0003]但是，一方面，许多常见的临床药物疏水性较大，难以分散在水性液体环境中，造成给药方式和药物吸收的困难。通过静脉给药时，需要使用Cremphor等助溶剂,而这些助溶剂的使用有可能引起严重的临床副作用。而且，通过使用助溶剂的给药方式所造成的药理活性成份在疾病组织和靶点的富集效果有限。另一方面，许多水溶性好的临床药物分子的体内清除速度快，血药浓度下降速度快，其治疗疗效有待进一步提高。
[0004]纳米技术对提高药物疗效有突出价值。一方面，纳米技术可以通过改善纳米颗粒本身在生物体内的药代药动过程而改善所携带药理活性成分在生物体内的药代药动过程。纳米技术能够有效提高疏水药理活性物质的溶解度和溶解速率，提高药理活性物质的生物可利用度。而且，纳米技术能够有效地延长药理活性成分的血液循环时间，提高药理活性成分在疾病组织和靶点的富集程度。
[0005]使用纳米技术改善药理活性物质的临床应用价值必须考虑以下问题:所使用的材料必须是临床安全的，所制备得到的纳米组合物的成份也都是临床安全的；制备得到的药理活性物质组合物的纳米结构应该保持稳定，在至少一种临床可接受的注射液中不发生严重的团聚或者解离。
[0006]在药理活性物质的组合物制备过程中，应尽量选择已经临床批准的材料作为原料，例如白蛋白、鱼精蛋白、抗体、免疫球蛋白等。以这些临床批准的材料为原料，经过与药理活性物质进行纳米组装可以得到成份安全的药理活性物质组合物，能够尽可能的保证所制备的药理活性物质组合物具有较高的临床安全性。制备得到的药理活性物质组合物的纳米结构经过临床可接受的注射液的稀释应该保持相对稳定的纳米结构，特别是最大粒径分布(透射电镜或者动态光散射分析(Number%统计，Malvern))应该仍保持在10-200nm范围内。一方面，如果药理活性物质组合物被注射液溶解稀释后发生严重的团聚，最大粒径分布增长到10-15微米级以上时，可能会引起毛细血管堵塞或梗塞，导致局部出血、缺血或缺氧和可能的组织死亡。另一方面，对于一些疾病的治疗，如肿瘤的治疗，疾病组织处的毛细血管具有增强的通透性和滞留性(EPR效应)，纳米粒子能够通过被动靶向方式有效地富集于肿瘤组织，这要求纳米粒子的粒径小于一定尺寸，有文献研究表明，尺寸小于400nm的纳米颗粒能够通过EPR效应富集于肿瘤部位(Cancer research, 1995,55
(17):3752-3756.)，还有研究表明，尺寸小于200nm的纳米颗粒能够更有效地富集于肿瘤部位(Nature nanotechnology, 2007, 2 (12):751-760.)。而且，有研究表明，直径 10nm左右的纳米药物能够最有效地富集于肿瘤组织(Int.J.Pharm.，121 (1995)，195-203 ；Nature nanotechnology, 2011, 6 (12):815-823),而血液中粒径小于 1nm 的纳米粒子容易通过肾小球的毛细血管过滤排出，被动祀向效果受到削弱(Nature Reviews DrugDiscovery, 2008, 7(9):771-782.)。因此，药理活性物质组合物的纳米结构尺寸在10_200nm范围内保持相对稳定极为重要，不但能够保证纳米材料的体内安全性，实现肿瘤等疾病组织的有效富集，而且能够通过200nm或者220nm滤膜过滤除菌。
[0007]—个药理活性物质的例子是紫杉醇。它是一种天然产物，首先是从太平洋紫杉树(Taxus brevifolia)分离出来(J.Am.Chem.Soc.93:2325 (1971))。在抗有丝分裂药中，含一个二萜碳骨架的紫杉醇对引起有丝分裂纺锤体形成的微管蛋白质呈现独特的作用模式。与其它抗有丝分裂药如长春碱或秋水仙碱阻止微管蛋白装配大不相同的是，紫杉醇是一种已知能抑制微管蛋白解聚过程、因而阻止细胞复制过程的植物产品。
[0008]紫杉醇这种天然存在的双萜类化合物对多种肿瘤显示有明显的抗肿瘤和抗癌作用。紫杉醇对范围广泛的肿瘤模型如B16黑素瘤、L1210白血病、MX-1乳房肿瘤和CS-1结肠肿瘤异种移植物有优异的抗肿瘤活性，并已广泛应用于临床肿瘤治疗。然而，紫杉醇的水溶解度低使对人给药成为问题。确实，输送在水性介质中固有地不溶或难溶的药物，如果口服输送无效可能会受到严重的损害。为此，目前所用的紫杉醇配方需要cremphor来使药物增溶。
[0009]在临床使用中，紫杉醇本身不显示过度的毒性作用，但用于增溶药物的乳化剂/助溶剂引起了严重的过敏反应。目前的给药制度包含在注射药物之前，给予病人抗组胺药和类固醇以减弱cremphor的过敏副作用。
[0010]为改进紫杉醇的水溶解度，几个研究人员用能赋予较高水溶解度的官能团修饰了它的化学结构。其中，磺化衍生物(Kingston等，美国专利5，059，699 (1991))和氨基酸酯(Mathew等，J.Med.Chem.35:145-151 (1992))显示有明显的生物活性。经修饰产生的水溶性衍生物有利于静脉内输送溶解在无害载体如生理盐水中的紫杉醇。然而，这种修饰使药物制剂的成本增加，可能诱发不需要的副反应和/或过敏反应，可能降低药物的疗效。
[0011]文献曾报道过用蛋白质微球作为药理活性物质或诊断产品的载体。用热变性或化学交联的方法制备了白蛋白微球。热变性微球是从一种乳化的混合物(例如，将要掺入的物质白蛋白和一种合适的油)在温度100°C至150°C之间制备的。然后，用一种适宜的溶剂将微球洗漆并储存备用。Leucuta等(Internat1nal Journal of Pharmaceutics41:213-217(1988))介绍了热变性微球的制备方法。
[0012]制备化学交联微球的过程包括用戊二醛处理乳剂以将蛋白质胶联，然后洗涤和储存备用。Lee等(Science213:233-235 (1981))和美国专利N0.4，671，954介绍了这种制备方法。
[0013]上述方法制备的蛋白质微球尺寸大于10微米,静脉方式给药的临床安全风险较大，限制了其进一步临床应用的可能性。
[0014]制备含药纳米颗粒的一种常规方法是将聚乳酸或其它生物亲容性的水不溶性聚合物溶于与水不溶混的溶剂(如二氯甲烷或其它氯化的、脂肪或芳香溶剂)内，将药理活性物质溶解于此聚合物溶液中，在油相或水相中加入表面活性剂，通过适当的方法形成水包油乳剂，于真空下将乳剂缓慢蒸发。如油滴足够小并在蒸发时稳定，就得到一种聚合物的水混悬液。因为药物在开始时就存在于聚合物溶液中，所以用这种方法可能得到一种组合物，其中药物分子在其内被由一种聚合基质形成的颗粒所捕捉。有研究人员报告了用溶剂蒸发制备含各种药物的微球和纳米颗粒的方法，例如参见Tice和Gilley, Journal ofcontrolled Release2:343-352 (1985) ；Bodmeier 和 McGinity, Int.J.Pharmaceutics43:179 (1988);Cavalier 等，J.Pharm.Pharmacol.38:249 (1985);和 d’Souza 等，W094/10980。
[0015]临床上市药物Abraxane是通过乳液法结合高压均质制备出粒径约为130nm的白蛋白紫杉醇纳米药物。其制备过程必须使用与水不互溶的有机溶剂溶解药理活性物质，与白蛋白水溶液混匀形成两相的有机相和水相，再经过高压均质形成尺寸小于200nm的颗粒(参考US005916596A ;CN1515244A)。但是Abraxane粉末在临床使用中迅速解离形成尺寸小于1nm的单个白蛋白尺寸大小的颗粒，并没有改善紫杉醇分子的生物分布和血液循环时间(Chem.Soc.Rev.，2012, 41，2971-3010)。因此，通过改变工艺制备纳米结构稳定的白蛋白/药理活性物质组合物，通过肿瘤部位的EPR效应提高药理活性物质在肿瘤部位的富集效果，改善生物分布，这些都是本领域亟需解决的问题。
【发明内容】
[0016]针对现有技术的不足，本发明提供一种基于蛋白质的药理活性物质组合物，所述组合物不需要加入乳化剂和增溶剂，因此避免引起过敏反应，并且不会因注射液的溶解稀释迅速解离至1nm尺寸以下，因此提高在肿瘤部位的富集效果，改善生物分布。本发明还提供所述组合物的制备方法及其应用。
[0017]在第一方面，本发明提供一种药理活性物质输送系统，包括固体或液体的药理活性物质及蛋白质包衣构成的颗粒，其中所述蛋白质包衣具有与其缔合的游离蛋白质，所述药理活性物质的一部分包含在所述蛋白质包衣中，所述药理活性物质的另一部分与游离蛋白质缔合；所述颗粒的平均直径为10至200nm，其分散于水性溶液时的最大动力学水合粒径在1nm以上。
[0018]具有上述特征的药理活性物质输送系统通过静脉注射进入人体血液中后，与游离蛋白质缔合的那部分药理活性物质能够快速释放，但是包含在所述蛋白质包衣中的那部分药理活性物质不会在短时间内快速释放，而是在一个较长的时间内缓慢稳定地释放，因此改善了血液循环时间。本发明的药理活性物质输送系统与此前报道的此类组合物的最显著的区别在于本发明的药理活性物质输送系统的颗粒的平均直径为10至200nm，其分散于水性溶液时的最大动力学水合粒径在1nm以上，避免了肾小球的毛细血管过滤排出而导致的被动靶向效果削弱；此前报道的此类组合物分散于水性溶液时，其最大动力学水合粒径迅速降低到1nm以下，由于肾小球的毛细血管过滤排出而导致被动靶向效果削弱。
[0019]本发明中，所谓“水性溶液”是指水、生理盐水、缓冲溶液、葡萄糖溶液、维生素溶液、氨基酸溶液或它们的混合物等生物可接受的水性溶液。本发明特别研究了生理盐水作为水性溶液用于稀释所述药理活性物质输送系统的情况，在0.lmg/mL的生理盐水中，所述颗粒的最大动力学水合粒径在10nm左右。因此，作为本发明的优选，所述颗粒分散于0.lmg/mL的生理盐水时的最大动力学水合粒径在1nm以上、优选在20nm以上、更优选 50-180nm,例如 60nm、70nm、80nm、lOOnm、120nm、150nm、160nm、170nm、175nm、60-150nm、70-100nm、80-120nm、120_150nm 或 130_170nm。
[0020]本发明所述药理活性物质输送系统可以是以颗粒干粉的形式存在，也可以将所述药理活性物质输送系统的颗粒悬浮于生物相容性水溶液中。其中，所述生物相容性水溶液可以为可接受的注射液，更优选为生理盐水、葡萄糖注射液或缓冲液。
[0021]在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的药理活性物质输送系统的方法，包括:
[0022]( I)将蛋白质、药理活性物质、生物相容性水溶液和与水互溶的有机溶剂混合制成混合溶液；
[0023](2)除去与水互溶的有机溶剂再进行高压均质，或者进行高压均质再除去与水互溶的有机溶剂，得到纳米悬浮液，然后通过干燥得到干粉状的药理活性物质输送系统。
[0024]本发明的