方法与现有技术最显著的区别在于采用与水互溶的有机溶剂代替现有技术中的与水不互溶的有机溶剂。发明人出乎意料地发现本发明的方法制得的药理活性物质输送系统不会因注射液的溶解稀释迅速解离至1nm尺寸以下。
[0025]本发明的方法中，药理活性物质可以是水不溶性(疏水性)药理活性物质、水溶性(亲水性)药理活性物质或双亲性药理活性物质。
[0026]针对水不溶性药理活性物质，可以通过以下步骤制备混合溶液:
[0027](Ia)将蛋白质溶于生物相容性水溶液中，形成蛋白质溶液；将水不溶性药理活性物质溶于与水互溶的有机溶剂中，形成药理活性物质溶液；
[0028]( Ib)将所述药理活性物质溶液与所述蛋白质溶液混合。
[0029]针对水溶性药理活性物质，可以通过以下步骤制备混合溶液:
[0030]( Ia)将蛋白质和水溶性药理活性物质共同溶于生物相容性水溶液中，形成蛋白质/水溶性药理活性物质混合溶液；
[0031]( Ib)将与水互溶的有机溶剂与所述蛋白质/水溶性药理活性物质混合溶液混合。
[0032]针对双亲性药理活性物质，可以选择上述二者之一。
[0033]本发明的方法中，所述蛋白质选自白蛋白、鱼精蛋白、抗体、免疫球蛋白、酪蛋白、胰岛素、溶菌酶、纤维蛋白原、脂肪酶、胶原蛋白、纤维连接素、玻璃连接素、去铁蛋白、铁蛋白、血红蛋白中的一种或多种，优选人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、鱼精蛋白、抗体、铁蛋白或去铁蛋白，最优选人血清白蛋白。
[0034]本发明的方法中，所述药理活性物质选自抗肿瘤药、镇痛剂/退热剂、麻醉剂、平喘药、抗生素、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗真菌剂、抗高血压药、消炎药、肿瘤并发症辅助治疗生物技术药物、抗焦虑药、免疫抑制剂、抗偏头痛药、镇静剂/安眠药、抗心绞痛药、抗精神病药、抗躁狂药、抗心律失常药、抗关节炎药、痛风剂、抗凝剂、溶栓剂、抗纤溶药、血液流变学剂、抗血小板药、抗惊厥药、抗帕金森药物、抗组胺药/止痒药、钙调节剂、抗菌剂、抗病毒药、抗微生物药、抗感染药、支气管扩张药、激素、降血糖药、降血脂药、蛋白质、核酸、红血球生成刺激剂、抗溃疡/抗反流剂、止恶心药/止吐剂、维生素或成像剂。
[0035]本发明的方法中，所述生物相容性水溶液为可接受的注射液，更优选为生理盐水、葡萄糖注射液或缓冲液。
[0036]本发明的方法中，所述与水互溶的有机溶剂选自乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲亚砜、丙酮、乙腈、甲醇、丙醇、丙三醇、辛醇、二氧六环和甲基吡咯烷酮中的一种或多种的混合溶剂。
[0037]本发明的方法中，所述步骤(2)中除去与水互溶的有机溶剂的方法包括:喷雾干燥、减压蒸发、冷冻干燥、采用降膜蒸发器、透析或超滤。
[0038]本发明的方法中，所述高压均质的操作压力在3000-30000磅/英寸2内，更优选在6000-25000磅/英寸2内，最优选在9000-18000镑/英寸2内。
[0039]本发明的方法中，所述干燥的方法包括冷冻干燥、喷雾干燥、减压蒸馏或它们的组八口 ο
[0040]在第三方面，本发明提供第一方面所述的药理活性物质输送系统在制备将药理活性物质输送到受试者的药物制剂中的应用。
[0041]本发明还提供第一方面所述的药理活性物质输送系统在制备减少药剂副作用的药物制剂中的应用。
[0042]本发明的有益效果为:相对于现有技术，本发明不使用与水不互溶的有机溶剂，而是使用与水互溶的有机溶剂溶解药理活性物质，制备药理活性物质输送系统，其分散于水性溶液时的最大动力学水合粒径在1nm以上，避免了肾小球的毛细血管过滤排出而导致的被动靶向效果削弱，因此本发明的药理活性物质在肿瘤部位的富集效果及生物分布得到改善。采用本发明的药理活性物质输送系统对MCF-7人乳腺癌细胞进行处理显示其对MCF-7人乳腺癌细胞具有很强的抗增殖作用，对肿瘤动物模型进行治疗的药效试验显示其能显著抑制肿瘤的生长。
【附图说明】
[0043]图1为本发明实施例1中白蛋白-紫杉醇纳米粒子用生理盐水复溶(lmg/mL)的粒径分布图(曲线I)和市售Abraxane用生理盐水复溶(lmg/mL)的粒径分布图(曲线2)。
[0044]图2为本发明实施例1中白蛋白-紫杉醇纳米粒子用生理盐水复溶(0.lmg/mL)的粒径分布图(曲线I)和市售Abraxane用生理盐水复溶(0.lmg/mL)的粒径分布图(曲线2)。
[0045]图3为本发明实施例1中白蛋白-紫杉醇纳米粒子用于体外治疗MCF-7乳腺癌细胞的实验结果。
[0046]图4为本发明实施例1中白蛋白-紫杉醇纳米粒子用于治疗MCF-7乳腺癌荷瘤小鼠的实验结果，其中曲线I为治疗组结果，曲线2为对照组结果。
[0047]图5为本发明实施例1中白蛋白-紫杉醇纳米粒子通过静脉注射MCF-7乳腺癌荷瘤小鼠后，在不同器官的分布情况。
【具体实施方式】
[0048]下面将对本发明进行详细阐述。
[0049]本发明采用反溶剂法结合高压均质生成药理活性物质纳米颗粒。反溶剂法和高压均质的结合极为重要，反溶剂法能够将蛋白质与药理活性物质结合在一起并形成大于1nm的团聚物质,高压均质能够减小纳米粒子的颗粒尺寸至200nm以下,便于使用200nm或220nm孔径的滤膜过滤除菌。本发明的药理活性物质纳米颗粒是按照高剪切力条件(例如超声处理或高压均质等)制备的纳米制剂，不需使用任何常规表面活性剂，并且不需使用任何聚合物核心物质以形成纳米颗粒基质。本发明用蛋白质(例如人血清白蛋白或重组人血清白蛋白等)作为稳定剂。
[0050]通过调节高压均质的压力和高压均质的次数能够控制本发明纳米颗粒的粒径，以便通过0.22或0.2微米孔径的过滤器无菌过滤。生成的纳米颗粒能通过0.22微米孔径的过滤器过滤是极为重要和有意义的，这是由于蛋白质会热凝固，不能用常规方法如压热法灭菌。本发明提供的药理活性物质纳米颗粒在可接受的注射液的稀释下不易解离至1nm以下，这对于纳米粒子通过EPR效应被动靶向累积于肿瘤部位是极为重要的，这是由于1nm尺寸以下的纳米粒子容易通过肾小球过滤迅速排出体外,削弱纳米粒子的被动祀向能力(Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7 (9):771-782.)。
[0051]本发明提供的药理活性物质输送系统，包括固体或液体的药理活性物质及蛋白质包衣构成的颗粒，其中所述蛋白质包衣具有与其缔合的游离蛋白质，所述药理活性物质的一部分包含在所述蛋白质包衣中；所述药理活性物质的另一部分与游离蛋白质缔合，在给予哺乳动物时可立即生物有效。
[0052]大量在血液中循环的常见药理活性物质通过疏水或离子相互作用与载体蛋白质结合，其中最普通的例子是血清白蛋白。本发明的方法和由此而产生的组合物是在给药前已“预先通过疏水或氢键或极性作用或离子相互作用或物理包埋或静电作用结合”蛋白质的药理活性物质。
[0053]利用人血清白蛋白结合紫杉醇以及其它药物的能力可以提高紫杉醇并入颗粒表面的能力。因为白蛋白出现在胶体药物颗粒(在除去有机溶剂时形成)上，由于电排斥和空间稳定的合并作用，促进了能长时间稳定的胶体分散体的形成。
[0054]本发明也提供能在水或生理盐水中重组的粉末形式亚微米颗粒。这种粉末是在除去水分后经冷冻干燥得到的。人血清白蛋白作为本发明纳米颗粒的结构组分，也作为冷冻保护剂和重组辅助剂。本发明方法制备的能通过0.22微米或者0.2微米孔径的过滤器过滤的颗粒，经干燥或冷冻干燥后产生可供静脉内注射用的无菌固体配方。
[0055]本发明提供的供体内输送的药理活性物质制剂的制备方法包括:
[0056]将药理活性物质、与水互溶的有机溶剂和蛋白质的水性介质进行混合得到混合物(在该混合物内不含表面活性剂)并置于压力范围在3000至30000磅/英寸2的高压均质器内。有机溶剂可以在经受高剪切条件处理后，有选择性地从混合物中除去；也可以先从混合物中有选择的除去，再接受高剪切条件处理。
[0057]上述形成混合物的过程可以是将有机溶液加入至水性溶液，也可以是将水性溶液加入至有机溶剂，混合过程中的条件可以是超声、磁搅拌、机械搅拌、匀浆或高剪切搅拌器，也可以是其他可以促进两者混合的方法。混合之前，水不溶性药理活性物质可以溶解在有机溶剂中，水溶性和双亲性药理活性物质可以预先溶解在白蛋白的水性溶液中。
[0058]在研究过程中，本发明人充分认识到，虽然在适当的条件下将药理活性物质、有机溶剂和蛋白质的水性溶液混合在一起也能得到最大粒径分布小于200nm的组合物,但是可控性较差，不同批次之间的差异较大，不利于放大生产，尽管多次努力提高药理活性物质的载药量都难以同时接近Abraxane的载药量(10%)和最大动力学水合直径(约100_130nm)，在实际生产中，会给产品质量控制、放大生产带来巨大困难，难以通过200nm或者220nm孔径滤膜过滤除菌，安全性和有效性难以得到保障，从而限制其临床实际应用。因而，本发明人经过艰苦的实验和工艺研究发现需要将药理活性物质、有机溶剂和蛋白质水性溶液的混合物进一步通过高压均质器进行加工处理(典型的操作压力在3000-30000磅/英寸2，在6000-25000磅/英寸2更好，最优选在9000-18000镑/英寸2)，才能使大部分(90%，Number统计)粒子的水合动力学直径小于200nm，有利于产品通过200nm或者220nm孔径滤膜过滤除囷。
[0059]除去混合物中的有机溶剂的方法包括喷雾干燥、减压蒸馏、冷冻干燥、降膜蒸发器、透析或超滤等方法。
[0060]为了得到可复溶的药理活性物质-蛋白质的复合物，需要将药理活性物质的蛋白质复合物的溶液干燥处理，干燥的方法包括旋转蒸发器、降膜蒸发器、喷雾干燥器、冷冻干燥器或类似设备。干燥处理得到的粉末含药理活性物质和蛋白质，可于任何合适的时间，在适宜的水性介质中再分散以得到能对哺乳动物给药的混悬液。
[0061]本发明用上述方法制备的组合物在可接受的注射液溶解稀释情况下，不易解离成1nm尺寸以下。
[0062]本发明用上述方法制备的组合物，例如紫杉醇和白蛋白形成的纳米颗粒，不但毒性低，而且没有骨髓抑制作用。
[0063]本发明中，“体内输送”是指经由口服、静脉内、皮下、腹腔、鞘内、肌内、吸入、外用、经皮、直肠、阴道或类似途径输送药理活性物质。
[0064]本发明中，“水性溶液”是指含水的液体，包括水、生理盐水、缓冲溶液、葡萄糖溶液、维生素溶液、氨基酸溶液或者其它生物可接受的水性溶液或者其混合物。
[0065]本发明中，“生物相容性”是指物质不会明显地以任何有害的方式改变或影响它被引入的生物系统。
[0066]本发明中，“(药理活性物质)输送系统”、“(药理活性物质)组合物”、“(药理活性物质)制剂”、“(药理活性物质)纳米颗粒”和“(药理活性物质-蛋白)复合物”及其它类似概念在一定程度上含义是相同的。在具体的语境中在不产生矛盾的前提下，这些概念是可以替换的。
[0067]与本发明不同的是，现有Abraxane (白蛋白结合型紫杉醇)的制备过程中明确表示必须使用与水不互溶的有机溶剂(如氯仿)，否则无法实现。而且，Abraxane药物粉末在用生理盐水溶解稀释过程中，非常容易解离至1nm以下,例如，lmg/mL的Abraxane的生理盐水溶液的最大动力学水合粒径分布约为10nm,而经生理盐水