产生肾前体细胞的方法及含有肾前体细胞的药物的制作方法

产生肾前体细胞的方法及含有肾前体细胞的药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种由多能干细胞诱导分化肾前体细胞的方法。本发明还涉及一种含 有这样得到的肾前体细胞的肾病治疗剂。
【背景技术】
[0002] 肾脏为通过将由生物体内的代谢活动产生的有害物质等废物从血液中过滤而除 去以谋求维持身体的健康而起作用的重要的器官之一。作为肾脏的疾病，可列举肾功能不 全等，作为治疗方法，可列举人工透析。但是，由于该治疗中需要的医疗费用负担大，因此， 不仅从医学方面、而且从医疗经济面考虑，都依然为世界性问题。另外，作为其他治疗方法， 可列举肾移植，但却是极其严重的供体器官不足状态。
[0003] 另一方面，迄今为止，报导了通过向胚胎干细胞（ES细胞）或体细胞导入未分化细 胞特异性的基因而得到的诱导性多能干细胞（iPS细胞）等具有多能性的细胞（专利文献 1及2)。因此，作为肾功能不全的治疗方法，研究了将由这些多能干细胞诱导分化成的肾细 胞进行移植的治疗方法。进而，使用来自这些多能干细胞的均一的肾细胞进行治疗药物的 开发也映入视野。
[0004] 哺乳动物的肾脏经过前肾、中肾、后肾的3个阶段而形成，其中，已知后肾在间介 中胚层的后方区域生成。迄今为止，研究了由小鼠多能干细胞向间介中胚层的诱导分化方 法用于肾形成（非专利文献1)，作为间介中胚层的特征标记物，确认有0SR1。另外，使用细 菌人工染色体（BAC)载体将绿色荧光蛋白（GFP)基因通过与内源性0SR1等位基因的同源 重组而导入，制备了人iPS细胞（0SR1-GFP报告基因人iPS细胞），通过使用该细胞的研究， 在使用激活素A、Wnt、BMP及各种低分子化合物的由人多能干细胞向间介中胚层的诱导分 化方面取得了成功（非专利文献2、专利文献3)。
[0005] 考虑针对肾组织的移植时，优选诱导来自间介中胚层并进一步向肾脏进行分化的 肾前体细胞，作为对肾前体细胞赋予特征的因子之一，已知有SIX2 (非专利文献4)。但是， 迄今为止，由间介中胚层向肾前体细胞人工诱导的方法没有被确立。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1 :美国专利第5, 843, 780号
[0009] 专利文献2 :国际公开第W02007/069666号
[0010] 专利文献3 :国际公开第W02012/011610号
[0011] 非专利文献
[0012] 非专利文献 1:MaeS，etal. (2010)，BiochemBiophysResCommun. 393 :877-82
[0013] 非专利文献 2:MaeS，etal. (2013)，NatCommun. 4 :1367
[0014] 非专利文献 3 :0safuneK，etal· (2006)，Development. 133 :151-61
[0015] 非专利文献 4:KobayashiA，etal· (2008)，CellStemCell. 3 :169-81

【发明内容】

[0016] 本发明的课题在于，提供一种由间介中胚层细胞诱导分化肾前体细胞的方法。更 具体而言，提供一种由间介中胚层细胞诱导分化肾前体细胞的方法，所述方法包括将由多 能干细胞诱导成的间介中胚层细胞进一步诱导分化为肾前体细胞的工序。
[0017] 本发明人等为了解决上述的课题进行了深入研究，结果最初发现：通过在含有 TGF0信号激活剂及BMP抑制剂的培养基中进行培养，可由间介中胚层细胞诱导分化肾前 体细胞。本发明是基于这样的见解而完成的。
[0018]gp，本发明具有以下的特征：
[0019] [1]-种由间介中胚层细胞产生肾前体细胞的方法，所述方法包括：将间介中胚 层细胞在含有TGF0信号激活剂及BMP抑制剂的培养基中进行培养，由间介中胚层细胞诱 导肾前体细胞的工序。
[0020] [2]如[1]所述的方法，其中，所述肾前体细胞为SIX2阳性细胞。
[0021] [3]如[1]或[2]所述的方法，其中，所述间介中胚层细胞为0SR1阳性细胞。
[0022] [4]如[1]~[3]中任一项所述的方法，其中，所述TGF0信号激活剂为选自由 TGF0 1、TGF0 2、TGF0 3、IDE1及IDE2构成的组中的1种以上的物质。
[0023] [5]如[1]~[4]中任一项所述的方法，其中，所述BMP抑制剂为选自由 Dorsomorphin(卜'、；py乇；1^7 4 >)、头蛋白（Noggin)、LDN193189 及DMH1 构成的组中的 1 种以上的物质。
[0024] [6]如[1]~[3]中任一项所述的方法，其中，所述TGF0信号激活剂为TGF0 1， 所述BMP抑制剂为DMH1。
[0025] [7]如[1]~[6]中任一项所述的方法，其中，所述间介中胚层细胞为由多能干细 胞诱导成的间介中胚层细胞。
[0026][8]如[7]所述的方法，其中，所述间介中胚层细胞为通过包括以下的工序⑴及 (ii)的方法所产生的间介中胚层细胞：
[0027] (j)将多能干细胞在含有选自由激活素（Activin)A、GSK-30抑制剂及视黄酸衍 生物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
[0028](ii)将工序⑴中得到的细胞在含有选自由BMP7、GSK_3i3抑制剂及视黄酸衍生 物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
[0029] [9]如[8]所述的方法，其中，所述工序（ii)包括以下的工序（ii-Ι)及（ii-2):
[0030] (ii-Ι)将工序（i)中得到的细胞在含有选自BMP7及GSK-3β抑制剂中的1种以 上的物质的培养基中进行培养的工序；及
[0031] (ii-2)将工序（ii-Ι)中得到的细胞在含有选自TGF0信号激活剂及视黄酸衍生 物中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
[0032] [10]如[9]所述的方法，其中，所述工序（ii-Ι)为在含有BMP7及GSK-3I3抑制剂 的培养基中进行培养的工序，所述工序（ii-2)为在含有TGF0信号激活剂及视黄酸衍生物 的培养基中进行培养的工序。
[0033] [11]如[8]~[10]中任一项所述的方法，所述GSK3 0抑制剂为CHIR99021。
[0034] [12]如[8]~[11]中任一项所述的方法，其中，所述视黄酸衍生物为AM580或 TTNPBo
[0035] [13]如[7]~[12]中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干 (iPS)细胞。
[0036] [14]如[13]所述的方法，其中，所述iPS细胞为人iPS细胞。
[0037] [15]-种由多能干细胞产生肾前体细胞的方法，所述方法包括以下的工序⑴~ (iii)：
[0038] (i)将多能干细胞在含有选自由激活素A、GSK_3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的 组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；
[0039] (ii)将工序⑴中得到的细胞在含有选自由BMP7、GSK_3i3抑制剂及视黄酸衍生 物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
[0040] (iii)将工序（ii)中得到的细胞在含有TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的培养基 中进行培养的工序。
[0041] [16]如[15]所述的方法，其中，所述肾前体细胞为SIX2阳性细胞。
[0042] [17]如[15]或[16]所述的方法，其中，所述工序（ii)中得到的细胞为0SR1阳性 细胞。
[0043] [18]如[15]~[17]中任一项所述的方法，其中，所述TGF0信号激活剂为选自由 TGF0 1、TGF0 2、TGF0 3、IDE1及IDE2构成的组中的1种以上的物质。
[0044] [19]如[15]~[18]中任一项所述的方法，其中，所述BMP抑制剂为选自由 Dorsomorphin、Noggin、LDN193189及DMH1构成的组中的1种以上的物质。
[0045] [20]如[15]~[17]中任一项所述的方法，其中，所述TGF0信号激活剂为 TGFβ1，所述BMP抑制剂为DMH1。
[0046] [21]如[15]~[20]中任一项所述的方法，其中，所述工序（ii)包括以下的工序 (ii-Ι)及（ii-2):
[0047] (ii-Ι)将工序（i)中得到的细胞在含有选自BMP7及GSK-3β抑制剂中的1种以 上的物质的培养基中进行培养的工序；及
[0048] (ii-2)将工序（ii-Ι)中得到的细胞在含有选自TGF0信号激活剂及视黄酸衍生 物中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
[0049] [22]如[21]所述的方法，其中，所述工序（ii-Ι)为在含有BMP7及GSK-3I3抑制 剂的培养基中进行培养的工序，所述工序（ii-2)为在含有TGF0信号激活剂及视黄酸衍生 物的培养基中进行培养的工序。
[0050] [23]如[15]~[22]中任一项所述的方法，其中，所述GSK3β抑制剂为 CHIR99021。
[0051][24]如[15]~[23]中任一项所述的方法，其中，所述视黄酸衍生物为ΑΜ580或 ΤΤΝΡΒο
[0052] [25]如[15]~[24]中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干 (iPS)细胞。
[0053] [26]如[25]所述的方法，其中，所述iPS细胞为人iPS细胞。
[0054] [27]-种肾前体细胞，所述肾前体细胞通过[1]~[26]中任一项所述的方法来产 生。
[0055] [28]-种药物组合物，所述药物组合物含有通过[1]~[26]中任一项所述的方法 产生的肾前体细胞。
[0056] [29] -种肾病治疗剂，所述肾病治疗剂含有通过[1]~[26]中任一项所述的方法 产生的肾前体细胞。
[0057] [30]-种治疗肾病的方法，所述方法包括：将通过[1]~[26]中任一项所述的方 法产生的肾前体细胞施用于需要治疗的患者的工序。
[0058] [31]-种肾前体细胞，所述肾前体细胞通过[1]~[22]中任一项所述的方法来产 生，所述肾前体细胞用于肾病的治疗。
[0059] [32]通过[1]~[26]中任一项所述的方法产生的肾前体细胞在制备用于治疗肾 病的药物组合物中的用途。
[0060] 利用本发明能够首次实现由间介中胚层向肾前体细胞的人工诱导。进而，利用本 发明能够首次实现由多能干细胞（例如iPS细胞）向肾前体细胞的人工诱导。另外，确认 了通过本发明的方法产生的肾前体细胞具有对肾病模型动物的治疗效果。通过本发明的方 法产生的肾前体细胞可用于肾功能不全等肾病的治疗或再生医疗。
[0061] 本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请2013-123072号（申 请日：2013年6月11日）以及2014-92108号（申请日：2014年4月25日）的说明书和/ 或附图中所记载的内容。
【附图说明】
[0062] 图1表不实施例2~4中的诱导分化后的SIX2阳性细胞的含有率。图1A表不在 含有DMS0作为对照的培养基中进行培养后的结果。图1B表示利用诱导方法1(实施例2) 的结果。图1C表示利用诱导方法2 (实施例3)的结果。图1D表示利用诱导方法3 (实施 例4)的结果。图中，tdTomato表示报告基因。
[0063] 图2表示实施例5中的诱导分化后的SIX2阳性细胞的含有率。图2A表示在含有 DMS0作为对照的培养基中进行培养后的结果。图2B、C及D表示在诱导方法1的阶段3中 分别使用头蛋白（~〇区区;[11)、0)附93189及0]\1!11代替0〇『8〇1]1〇印11；[11(卜'、;1^> (：:￡;1^7 4>)时 的结果。图2E及F表示在诱导方法1的阶段3中分别使用IDE1及IDE2代替TGFβ1时的 结果。图2G表示在诱导方法1的阶段3中，使用TGFI3 2及LDN193189时的结果。图2Η表 示在诱导方法1的阶段3中，使用TGFI3 3及LDN193189时的结果。
[0064] 图3表示由人iPS细胞产生0SR1+SIX2+肾前体细胞的方法的一个实例。图3Α表 示使用EB(拟胚体）三维培养的向0SR1+SIX2+肾前体细胞的分化方法。图3B表示利用流 式细胞仪的〇SRl+SIX2+细胞的随时间推移的分化模式分析，具体而言，表示细胞群的二维 分布的结果（η= 5)。图3C表示针对分化细胞群中的表示的各基因的mRNA表达的时间过 程分析。图表表示第1天~第28天中的相对于β肌动蛋白表达的相对表达量（η= 3)。 图3D表示实施例7中的利用流式细胞仪的0SR1+SIX2+细胞的随时间推移的分化模式分 析，具体而言，表示该细胞群的时间过程分析的结果（η= 5)。图3D中，dl表示第1天中 的iPS细胞，d3表示在含有CHIR99021和激活素（Activin)A的培养基（阶段1)中产生 的EB(第3天）的结果。图3D中，d6~d28表示至第6天~第28天的DMS0组（记载为 DMS0)及TGFβ1+TTNPB处理组（记载为Tx)的结果。在阶段2 (第3天~第6天）中，在含 有CHIR99021和ΒΜΡ7的培养基中培养3天后，在第6天分为DMS0组和Τχ组，进行在阶段3 及阶段4的培养。需要说明的是，在DMSO组中，在阶段3中，取代TGFβ1及TTNPB，在含有DMS0的培养基中进行培养，（在第8天，交换为相同的培养基），在阶段4中，取代TGFβ1及 DMH1，在含有DMS0的培养基中进行培养（每3天1次交换为相同的培养基）。图3Ε表示由 培养第28天的4A6C3-10分化成的0SR1+SIX2+肾前体细胞中的肾前体细胞标记物表达。
[0065] 图4表示TGF0信号激活剂及BMP抑制剂的各组合用于由人iPS细胞诱导 0SR1+SIX2+细胞的效果。数据用平均值土S.E.Μ表示（η= 5)。
[0066] 图5表示通过利用各种人iPS细胞及人ES细胞的诱导方法4的分化诱导的结 果（0SR1表达量（图5A)及SIX2表达量（图5B))。表示各细胞中的0SR1及SIX2相对于 4A6C3-10中的表达量的的相对表达量。
[0067] 图6表示肾前体细胞的评价试验的结果。图6A表示将0SR1+SIX2+细胞在REGM培 养基中培养7天后的免疫染色图像。图中，NEPHRIN表示肾小球足细胞的标记物，AQP1及 MEGALIN表示肾小管近曲小管的标记物，且UR0MUC0ID表示亨利氏环的标记物。对该各标记 物和核分别被染色为粉红色和蓝色。比例尺表示50μm。图6B表示将0SR1+SIX2+细胞的细 胞团块与表达Wnt4的NIH3T3共培养7天后的显微镜图像（左图）及免疫染色图像（3个 右图）。图6C表示将0SR1+SIX2+细胞的细胞团块与E11. 5的小鼠胚脊髓共培养7天后的显 微镜图像（左图）及免疫染色图像（3个右图）。图6D表示将0SR1+SIX2+细胞的细胞团块 与E11. 5的小鼠胚胎后肾细胞器官培养后的免疫染色图像。图6E表示对将0SR1+SIX2+细胞 的细胞团块向NOD.CB17-Prkdcsel