人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的内向整流的电子表达的制作方法
【专利说明】人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的内向整流的电子表达
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求提交于2013年5月17日的第61/824, 507号美国临时申请的优先权， 其公开的内容通过引用并入本文中。
[0003] 关于联邦资助的声明
[0004] 本发明是在来自美国国立卫生研究院的授权号为HL093631和HL062465的政府支 持下完成的。政府对本发明具有一定的权利。
【背景技术】
[0005] 术语"诱导多能干细胞"或iPSC是指由非多能细胞人工制备的一类多能干细胞。iPSC衍生的心肌细胞是有用的实验系统，该系统具有很大的潜能。他们为心脏修复、药物的 安全性设计和测试、临床诊断和研究提供创新的人源制剂。iPSC衍生的心肌细胞提供了影 响重现健康的人心肌细胞的活动的细胞的机会，否则其很少用于综合实验研究。人源iPSC 衍生的心肌细胞提供了开发心功能预测工具的能力。
[0006] 尽管有iPSC衍生的心肌细胞的可能性，然而已经注意到这种方法的问题，引起关 于它们在研究心律失常机制和药物安全性筛选中使用的严重关注。iPSC衍生的人源心肌 细胞的动作电位（AP)通常称作"不成熟表型"。缺乏预期的典型尖峰和穹顶类型的AP形态 引起了对iPSC衍生的人心肌细胞用于研究Brugada综合征和其他J-波或早期复极化相关 的心律失常的遗传基础的能力的严重关注。除了明显不太复杂的复极化谱之外，iPSC心肌 细胞也显示自发收缩活动。这种收缩活动伴随着相应的舒张期去极化，而产生自发AP。因 此，虽然可以诱导iPSC发育成心肌细胞样细胞，但是它们未能表现出使这些细胞能用在心 肌细胞功能的评估中或用于作用于心肌细胞的药物的筛选中的电生理特性。
【发明内容】
[0007] 在本公开中，我们通过在电流钳下将IK1分量以电子方式添加到人源iPSC衍生的 心肌细胞中来评估减少这些心肌细胞中的内向整流电流ακ1)的作用。该方法表明了 ^的 强大影响力以及在复极化和潜在地致心律失常行为方面其表达产生重要的生理差异的程 度。我们证明了人工替换1"产生具有ΑΡ的人源iPSC衍生的心肌细胞，该心肌细胞在ΑΡ 行为上更接近于新分离的人源心肌细胞。
[0008] 在一个方面，本公开提供了用于改善iPSC衍生的心肌细胞的动作电位形态的系 统。改善的AP形态可以包括，例如，生理静息膜电位、尖峰和穹顶动作电位。该系统包括具 有用于测量肌细胞的膜电压的膜片钳和与电极电子通信的生成电路。生成电路被配置为基 于膜电压计算内向整流电流的值并基于计算出的值将合成的内向整流电流施加到所述肌 细胞。
[0009] 该方法有很多应用并使该电生理系统的综合分析成为可能，还允许筛选对心房或 心室细胞缺陷特异的药物。本公开的iPSC心肌细胞可用于离子通道病的解释、药物筛选和 潜在心律失常发生的评估。通过消除许多自发活动和不稳定行为的非生理性结果，该工具 对研究复极化的动力学是有用的。它已应用到察看疾病状态中复极化的基因调控的研究性 学习中，以及充当药物研究中的数据判读和药物性心律失常电位的安全性筛选中的辅助工 具。根据所获得的数据，它也可以用来修改治疗方案。
[0010] 在一个方面，本公开提供了用于在iPSC衍生的心肌细胞中产生具有改善形态的 动作电位的方法。该方法包括测量肌细胞的膜电压的步骤；基于所测量的膜电压计算内向 整流电流的值；以及将合成的内向整流电流施加到肌细胞从而使肌细胞产生具有改善形态 的动作电位。
[0011] 在一个方面，本公开提供了用于区分具有心房细胞样的电性特征的iPSC衍生的 心肌细胞与表现出心室细胞样的电性特征的iPSC衍生的心肌细胞的方法。
[0012] 在一个方面，本公开提供了用于筛选可以影响心房细胞或心室细胞的电性特性的 候选试剂的方法。该方法包括鉴别iPSC衍生的心肌细胞是否表现出心房表型或心室表型， 然后测试假定药物影响心房功能或心室功能的效果。
[0013] iPSC心肌细胞能够用于离子通道病的解释、药物筛选和潜在心律失常发生的评 估。通过消除许多自发活动和不稳定行为的非生理性结果，该工具对研究复极化的动力学 是有用的。它已应用到察看疾病状态中的复极化的基因调控的研究性学习中，以及充当药 物研究中的数据判读和药物致心律失常电位的安全性筛选中的辅助工具。它也可以用来修 改根据所获得的数据的治疗方案。
【附图说明】
[0014] 图1:IK1电流的电子表达系统的组织。响应于肌细胞膜电位实时生成Ικ??。对 于这个研究中的所有细胞，设置电位计以提供在_75mV时150ρΑ的标准外向电流。
[0015] 图2 :iPSC衍生的心肌细胞的自发ΑΡ。（Α)典型的自发ΑΡ，其具有典型的起搏器 型细胞的相对慢的舒张去极化和非常慢的上升冲程（dV/dt_)。（B)不规律的和DAD样行为 的实例。一般地，在电流钳期间自发活动表现出基本不规律性。这种不规律性常常显示出 具有噪声行为的大部分平坦舒张间期，和在动作电位的潜在前导启动的突然自发增加。（C， D):相同细胞中EAD样行为的实例。在c中，在约OmV单次搏动中存在AP的高电压延长。 在D中，该细胞在低电压（-20至-40mV)EAD样振荡中花了很长时间。
[0016] 图3.起搏静态和自发活动细胞。㈧无任何刺激下静止期细胞的典型静息电位。 (B)刺激（0· 5Hz4次搏动）静止期细胞（与（A)中相同）启动复杂行为和自动节律性。（C) 扩展时间范围内表现刺激性AP。（D)自发活动，在频率、舒张电位、过冲和形状上高可变性。 (E)起搏（0·25Ηζ4次搏动）自发活动细胞（如⑶中的肌细胞）产生更加一致的后超极 化电位且改变自发活动。（F)在扩展时间范围可以更容易地看到后超极化。
[0017] 图4 :合成的IK1表达和起搏之前和之后的AP。（A)自发心室型细胞。这些细胞显 示圆形的AP，但因为相对高的舒张电位降低了dV/dt_而难以进行区分。AP的"肩部"被 慢的IV阶段复极化所模糊。（B)(A)中的IK1的电子表达使去除1&失活的正常静息电位恢 复，由此增加(^/社_并复位其他电流。如It。的电流的复位产生心室肌细胞的典型的"尖 峰和穹顶"形态。（C)自发搏动心房细胞样细胞，其具有难以与心室细胞或节细胞区分的形 态。（D)IK1的电子表达揭示了图c中的细胞的心房性质。与心室肌细胞一样，负静息电位 恢复正常dV/dt并显示心房细胞的典型的特征尖峰和低的多三角形复极化相。（E，F)在扩 展时间范围（E)心房样AP和（F)心室样AP的复极化的详细信息。（G)细胞的APD3(]/APD9。 相对于apd3。的比值与IK1电子表达的散点图。
[0018] 图5.钙通道激动剂BayK8644的影响。㈧以4s的周期长刺激的AP。固有自动节 律性使得一些AP大大地缩短并且在来自先导自发搏动的复极化过程中发生一些刺激。三 个轨迹重叠。（B)相同的细胞，使用lyMBayK8644。BayK8644引起钙负荷，其终止自发活 动。刺激的AP表现出具有严重缩短的复极化的异常行为和很少的再生去极化的证据。三 个轨迹重叠。（C)与（A，B)相同的细胞，但具有Iaha的电子表达。AP具有正常的尖峰和 穹顶形态和一致的APD9。。在B之前记录这些轨迹。（D)与（A，B，C)相同的细胞，具有IK1j 成和1μΜ的BayK8644。APD被延长并且观察到交替的致心律失常性现象。一些AP被随后 的刺激中断。尽管有IK1的时间不变性质，电子表达使得交替的动态现象的观察易观 察。除了QT间期延长，交替的阈值变化是药物性心律失常电位的重要的细胞指数。（E)通 过IKli1^极小地改变了APD9()(n= 7)。这可能看起来矛盾，但添加IK1的净效应是复极化的 穹顶部分延长和复极化的最后阶段（或