可例示：W02007/069666、W02008/118820、 W02009/007852、W02009/032194、W02009/058413、W02009/057831、W02009/075119、 W02009/079007、W02009/091659、W02009/101084、W02009/101407、W02009/102983、 W02009/114949、W02009/117439、W02009/126250、W02009/126251、W02009/126655、 W02009/157593、W02010/009015、W02010/033906、W02010/033920、W02010/042800、 W02010/050626、W02010/056831、W02010/068955、W02010/098419、W02010/102267、 W02010/111409、W02010/111422、W02010/115050、W02010/124290、W02010/147395、 W02010/147612、HuangfuD，etal. (2008)，Nat.Biotechnol.，26 :795-797、ShiY，et al. (2008)，CellStemCell，2 :525-528、EminliS，etal. (2008)，StemCells. 26: 2467-2474、HuangfuD，etal. (2008)，Nat.Biotechnol.26 :1269_1275、ShiY，et al· (2008)，CellStemCell，3,568-574、ZhaoY，etal· (2008)，CellStemCell，3: 475-479、MarsonA，（2008)，CellStemCell，3,132-135、FengB，etal· (2009)，Nat.Cell Biol. 11 :197_203、R.L.Judsonetal·，（2009)，Nat.Biotechnol.，27 :459_461、Lyssiotis CA，etal· (2009)，ProcNatlAcadSciUSA. 106 :8912-8917、KimJB，etal· (2009)， Nature. 461 :649-643、IchidaJK，etal. (2009)，CellStemCell. 5 :491-503、HengJC， etal· (2010)，CellStemCell. 6 :167-74、HanJ，etal· (2010)，Nature. 463:1096-100、 MaliP，etal· (2010)，StemCells. 28 :713_720、MaekawaM，etal· (2011)，Nature. 474: 225-9中记载的组合。
[0089] 在体细胞中，非限定性地包含胎儿（胎児（仔））的体细胞、新生儿（婴儿）的体 细胞及成熟健康或患病的体细胞的任一种，另外，还包含原代培养细胞、传代细胞及细胞系 的任一种。具体而言，体细胞可例示例如（1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓 干细胞等组织干细胞（成体干细胞）、（2)组织前体细胞、（3)血液细胞（外周血细胞、脐带 血细胞等）、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞（皮肤细胞等）、毛细胞、 肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰细胞（胰外分泌细胞等）、脑细胞、肺细胞、肾细胞 及脂肪细胞等分化的细胞等。
[0090] 另外，将iPS细胞用作移植用细胞的材料的情况下，从不引起排斥反应的观点出 发，优选使用移植前的个体的HLA基因型相同或基本上相同的体细胞。在此，"基本上相同" 是指在针对移植的细胞利用免疫抑制剂而能够抑制免疫反应的程度上HLA基因型一致，例 如，为具有HLA-A、HLA-B及HLA-DR的3个基因座或加入有HLA-C的4个基因座一致的HLA 型的体细胞。
[0091] 在本发明中，在由多能干细胞向间介中胚层细胞的分化衍生时，可使用包括以下 的工序的方法：
[0092] ⑴将多能干细胞在含有选自由激活素A、GSK_3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的 组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序；及
[0093] (ii)将工序⑴中得到的细胞在含有选自由BMP7、GSK_3i3抑制剂及视黄酸衍生 物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序。
[0094] 以下，对各工序进一步进行说明。
[0095] ⑴将多能干细胞在含有选自由激活素A、GSK_3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的 组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序：
[0096] 本工序中，可将多能干细胞用本领域中公知的任何方法进行分离，通过悬浮培 养或贴壁培养进行培养。作为多能干细胞的分离的方法，可列举例如：机械分离、或使用 具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液（可列举例如Accutase(TM)及Accumax(TM) (InnovativeCellTechnologies，Inc))或仅具有胶原酶活性的分离溶液的分离。优选为 使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液进行解离、机械地细致地分散为单细胞的方 法。作为本工序中使用的人多能干细胞，优选采用相对于使用的培养皿培养至成为70%~ 80 %汇合的集落形态。
[0097] 本工序（i)中所使用的培养基可向用于动物细胞的培养的基础培养基添加选自 由激活素A、GSK_3i3抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质而制备。在1个 实施方式中，本工序中所使用的物质为激活素A及GSK-30抑制剂的组合、或GSK-30抑 制剂及视黄酸衍生物的组合。作为基础培养基，包含例如頂DM培养基、Medium199培养 基、伊格尔氏最小必需培养基（EMEM)培养基、αMEM培养基、杜氏改良的伊格尔氏培养基 (DMEM)培养基、Ham'sF12(F12)培养基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基、及它们的 混合培养基等。在培养基上既可含有血清（例如FBS)，或者也可以为无血清的。根据需要 可含有例如白蛋白、转铁蛋白、KnockOut血清替代物（KSR) (ES细胞培养时的血清替代物） (Invitrogen)、N2 补充剂（Invitrogen)、B27 补充剂（Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋 白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3' -硫醇甘油等1个以上的血清替代物，也可含有脂质、氨 基酸、L-谷氨酸、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需氨基酸（NEAA)、维生素、生长因子、低分子 化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等1种以上的物质。在本工序的1个实 施方式中，基础培养基为含有GlutaMAX、血清及抗生素的DMEM/F12。
[0098] 在本工序⑴中，在激活素A中包含来自人及其他动物的激活素A、以及它们的功 能性变体，例如可使用R&Dsystems公司等所市售的物质。本工序中使用的激活素A的浓 度为lng/ml~1000ng/ml，优选为 10ng/ml~500ng/ml，更优选为 50ng/ml~200ng/ml。
[0099] 在本工序（i)中，GSK-3β抑制剂只要可抑制GSK-3β的功能、例如激酶活性， 就没有特别限定，可列举例如作为靛玉红衍生物的ΒΙ0(别名：GSK-3i3抑制剂ΙΧ;6-溴 靛玉红-3' -肟）、作为马来酰亚胺衍生物的SB216763(3-(2,4-二氯苯基）-4-(1-甲 基-1H-吲哚-3-基）-1H-吡咯-2, 5-二酮）、作为苯基-α-溴甲基酮化合物的GSK-3β 抑制剂VII(α，4-二溴二苯甲酮）、作为细胞膜透过型的磷酸肽的L803-mts(别 名：GSK-3β肽抑制剂；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2:序列号1)及具有高的选择性的 CHIR99021(Nature(2008) 453 :519-523)。这些化合物例如可从Stemgent公司、Calbiochem 公司、Biomol公司等中获得，另外，也可自己制备。作为本工序中使用的优选的GSK-30抑 制剂，可列举CHIR99021。本工序中使用的GSK-3β抑制剂的浓度可根据所使用的GSK-3β 抑制剂而由本领域技术人员适当选择，例如使用CHIR99021作为GSK-3I3抑制剂时，为 0· 01μΜ~100μΜ，优选为0· 1μΜ~10μΜ，进一步优选为1μΜ~3μΜ。
[0100] 在本工序（i)中，视黄酸衍生物为保持天然的视黄酸具有的功能的可人工地进 行修饰的视黄酸，例如包含类维生素A化合物及维生素D3化合物。作为类维生素A化合 物的实例，可列举：视黄酸、3-脱氢视黄酸、4-[[ (5, 6, 7, 8-四氢-5, 5, 8, 8-四甲基-2-萘 基）幾基]氨基]_ 苯甲酸（4-[[(5, 6, 7, 8-tetrahydr0-5, 5, 8, 8-tetramethyl-2_naph thalenyl)carbonyl]amino]-Benzoicacid) (AM580)(TamuraK,etal. ,CellDiffer. Dev. 32 :17-26(1990))、4-[(lE)-2-(5,6, 7,8-四氢-5, 5,8,8-四甲基-2-萘基）-1-丙 稀-1-基]-苯甲酸（4_[ (IE) -2_ (5, 6, 7, 8_tetrahydr0-5, 5, 8, 8-tetramethyl-2_naphtha lenyl)-1-propen-l-yl]-Benzoicacid)(TTNPB)(StricklandS,etal. ,CancerRes. 43 ： 5268-5272 (1983))、及Tanenaga，K.etal·，CancerRes. 40 :914-919 (1980)中所记载的化 合物、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇、视黄醛、3-脱氢视黄醇、3-脱氢视黄醛等。视黄酸化合物 为在类维生素A化合物中具有羧基的化合物，可列举例如：视黄酸、3-脱氢视黄酸、AM580、 TTNPB等。在维生素D3化合物的实例中，可列举Abe,E.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 78 :4990-4994 (1981)、及Schwartz,E.L.etal·，Proc.Am.Assoc.CancerRes. 24 : 18(1983)中所记载的化合物。在本工序的1个实施方式中，视黄酸衍生物为类维生素A化 合物或维生素D3化合物。在本工序的其他实施方式中，视黄酸衍生物为类维生素A化合物， 另外，在其他实施方式中，视黄酸衍生物为视黄酸化合物。作为本工序中使用的优选的视黄 酸衍生物，可列举AM580或TTNPB。本工序中使用的视黄酸衍生物的浓度可根据所使用的 视黄酸衍生物而由本领域技术人员适当选择，例如，使用AM580或TTNPB作为视黄酸衍生物 时，为〇· 01μΜ~100μM，优选为0· 1μΜ~10μM，进一步优选为0· 5μΜ~2μM。
[0101] 本工序（i)中的培养基可进一步含有ROCK抑制剂。特别是在本工序含有使多能 干细胞分散为单细胞的工序的情况下，优选在培养基中含有ROCK抑制剂。
[0102] ROCK抑制剂只要可抑制Rho-激酶（ROCK)的功能，就没有特别限定，可列举例 如：Y-27632(例如参照Ishizakietal·，Mol.Pharmacol. 57,976-983 (2000);Narumiya etal.，MethodsEnzymol.325,273-284 (2000))、Fasudil/HA1077(例如参照Uenata etal·，Nature389 :990-994(1997))、H_1152(例如参照Sasakietal·，Pharmacol. Ther. 93 :225-232(2002) )、Wf-536(例如参照Nakajimaetal.，CancerChemother Pharmacol. 52(4) :319-324(2003))及它们的衍生物、以及ROCK对应的反义核酸、RNA干 扰诱导性核酸（例如siRNA)、负显性突变体、及它们的表达载体。另外，作为ROCK抑制 剂，也可使用其他公知的低分子化合物（例如参照美国专利申请公开第2005/0209261号、 第 2005/0192304 号、第 2004/0014755 号、第 2004/0002508 号、第 2004/0002507 号、第 2003/0125344 号、第 2003/0087919 号、及国际公开第 2003/062227 号、第 2003/059913 号、 第2003/062225号、第2002/076976号、第2004/039796号）。本发明中，可使用1种或2种 以上的ROCK抑制剂。作为本工序中使用的优选的ROCK抑制剂，可列举Y-27632。本工序中 使用的ROCK抑制剂的浓度可根据所使用的ROCK抑制剂而由本领域技术人员适当选择，例 如，使用Y-27632作为ROCK抑制剂时，为0·ΙμΜ~100μΜ、优选为ΙμΜ~50μΜ，进一步 优选为5μΜ~20μΜ。
[0103] 在本工序（i)中，培养温度并不限于以下，为约30~40°C，优选为约37°C，在含C02 的空气的氛围下进行培养。〇)2浓度为约2~5%，优选为约5%。本工序的培养时间为例 如2天以下的培养，优选为2天。
[0104] (ii)将工序⑴中得到的细胞在含有选自由BMP7、GSK_3i3抑制剂及视黄酸衍生 物构成的组中的1种以上的物质的培养基中进行培养的工序：
[0105] 本工序中，可在将上述工序（i)中得到的悬浮培养后的细胞群直接在进行了涂覆 处理的培养皿中、用任何培养基进行贴壁培养，或者也可将在上述工序（i)中通过贴壁培 养而得到的细胞通过培养基交换而继续培养。
[0106] 本工序（ii)中所使用的培养基可向用于动物细胞的培养的基础培养基中添加选 自由BMP7、GSK-3β抑制剂及视黄酸衍生物构成的组中的1种以上的物质而制备。在1个实 施方式中，本工序中所使用的物质为ΒΜΡ7及GSK-3β抑制剂的组合、或视黄酸衍生物。作为 基础培养基，包含例如頂DM培养基、Medium199培养基、伊格尔氏最小必需培养基（ΕΜΕΜ) 培养基、αΜΕΜ培养基、杜氏改良的伊格尔氏培养基（DMEM)培养基、Ham'sF12(F12)培养 基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基、及它们的混合培养基等。在培养基中，既可含有 血清（例如FBS)，或者可以为无血清的。根据需要可含有例如白蛋白、转铁蛋白、KnockOut 血清替代物（KSR) (ES细胞培养时的血清替代物）（Invitrogen)、N2补充剂（Invitrogen)、 B27补充剂（Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-疏基乙醇、3'-硫醇 甘油等1个以上的血清替代物，也可含有脂质、氨基酸、L-谷氨酸、GlutaMAX(Invitrogen)、 非必需氨基酸（NEAA)、维生素、生长因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐及它们 的同等物等1种以上的物质。在本工序的1个实施方式中，基础培养基为在DMEM和F12的 1 :1的混合培养基（DMEM/F12)中含有GlutaMAX、KSR、非必需氨基酸、2-巯基乙醇及抗生素 的培养基。
[0107] 在本工序（ii)中，例如可将工序⑴中得到的细胞在含有选自BMP7及GSK-3 0 抑制剂中的1种以上的物质的培养基中进行培养，其后在含有视黄酸衍生物的培养基中进 一步培养。优选在本工序（ii)中将工序（i)中得到的细胞在含有