用于hla的修饰的方法和组合物的制作方法

用于hla的修饰的方法和组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月12日提交的美国临时申请第61/777,627号的权益，其内 容据此通过引用整体并入。
[0003] 对在联邦资助的研究下进行的本发明的权利的声明
[0004] 不适用。
技术领域
[0005] 本公开属于基因表达、基因组工程和基因疗法的领域。
[0006] 背景
[0007] MHC抗原最先被表征为在移植反应中起主要作用的蛋白。排斥通过T细胞对植入 组织表面上的组织相容性抗原的反应的介导，并且这些抗原的最大的组是主要组织相容性 抗原（MHC)。这些蛋白在所有高等脊椎动物的表面上上表达，并且在小鼠中称为H-2抗原 (对于组织相容性-2抗原而言）和在人细胞中称为HLA抗原（对于人白细胞抗原而言）。
[0008] MHC蛋白在T细胞刺激中起着至关重要的作用。抗原呈递细胞（通常树突细胞） 在细胞表面上展示在MHC上的作为外来蛋白质的降解产物的肽。在共刺激信号存在的情况 下，T细胞被激活，并将作用于也展示相同肽/MHC复合物的靶细胞。例如被刺激的T辅助 细胞将靶向展示与其MHC结合的抗原的巨噬细胞，或细胞毒性T细胞（CTL)将作用于展示 外灭病毒肽的病毒感染的细胞。
[0009] MHC蛋白具有两种类型I类和II类。I类MHC蛋白是两种蛋白（为由MHC1I类基 因编码的跨膜蛋白的α链和为由不存在于MHC基因簇内的基因编码的小的细胞外蛋白的 β2微球蛋白链）的异二聚体。所述α链折叠成3个球状结构域，并且当β2微球蛋白链 被结合时，球状蛋白结构复合物与抗体复合物相似。外来肽被呈现在也是最可变的两个最 Ν末端结构域上。II类MHC蛋白也是异二聚体，但该异二聚体包含由MHC复合物内的基因 编码的两个跨膜蛋白。I类MHC:抗原复合物与细胞毒性Τ细胞相互作用，而II类MHC将抗 原呈递至辅助Τ细胞。另外，I类MHC蛋白倾向于在几乎所有有核细胞和血小板（以及在 小鼠中红细胞）中表达，而II类MHC蛋白被更加选择性地表达。通常地，II类MHC蛋白在 Β细胞、某些巨噬细胞和单核细胞、郎格尔汉斯细胞和树突细胞上表达。
[0010] 人中的I类HLA基因簇包含3个大基因座B、C和Α以及几个小基因座。II类HLA 簇也包含3个大基因座DP、DQ和DR，并且I类和II类基因簇是多态性的，因为在群体中 存在I类和II类基因的几个不同等位基因。还存在也在HLA功能中起作用的几种辅助蛋 白。Tap1和Tap2亚单位是在将肽抗原加载至I类HLA复合物所必需的TAP转运蛋白复合 物的部分，并且LMP2和LMP7蛋白体亚单位在将抗原蛋白水解成肽以在HLA上展示中起作 用。已显示LMP7的减少使细胞表面上的MHCI类的量减少，可能通过稳定化的不存在来实 现（见Fehling等（1999)Science265:1234-1237)。除了TAP和LMP以外，还存在甲巯蛋 白基因，其表达产物形成TAP复合物与HLAI类链之间的桥并且增加肽加载。甲巯蛋白的 减少导致具有受损的MHCI类装配的细胞，减少MHCI类的细胞表面表达和削弱免疫反应 (见Grandea等（2000)Immunity13:213-222 和Garbi等（2000)NatImmunol1:234-238) 〇
[0011] I类表达的调控通常是在转录水平上的，并且几种刺激物诸如病毒感染等可引起 转录的变化。I类基因在一些特定组织中被下调，并且该下调的来源似乎在启动子和3'基 因间序列内（见Cohen等（2009)PLosONE4(8):e6748)。还有证据表明微RNA能够调控一 些I类MHC基因（见Zhu等，（2010)Am.J.0bstetGynecol202(6):592)。
[0012] II类MHC表达的调控取决于MHCII增强体复合物的活性。增强体组分（得到 最高度研究的增强体复合物的组分之一是RFX5基因产物（见Villard等（2000)MCB 20(10):3364-3376))几乎被普遍地表达，并且这些组分的表达似乎不控制MHCII类基因 的组织特异性表达或它们的IFN-γ诱导的上调。相反地，作为非DNA结合蛋白的称为CIITA 的蛋白（II类反式激活因子）似乎用作MCHII表达的主控制因子。与其它增强体成员相反， CIITA确实展示组织特异性表达，被IFN-γ上调，并且已显示其被几种细菌和病毒抑制，所 述细菌和病毒可引起MHCII类表达的下调（被认为是试图逃避免疫监督的细菌的部分（见 LeibundGut-Landmann等（2004)Eur.J.Immunol34:1513-1525))。
[0013] I或II类基因的调控可在一些肿瘤存在的情况下被破坏，并且此类破坏可对患者 的预后具有后果。例如，在一些实施方案中，发现观察到的Tap1、Tap2和HLAI类抗原 的减少在转移性黑素瘤中比在原发性肿瘤中更常见（P〈〇.〇5)(见，Kagashita等（1999)Am JourofPathol154 (3):745-754)〇
[0014] 在人中，对几种疾病的易感性被怀疑与HLA单体型密切相关。这些疾病包括阿狄 森氏病、强直性脊柱炎、白塞氏病、伯格氏病、乳糜泻、慢性活动性肝炎、格雷夫斯病、幼年型 类风湿关节炎、银肩病、银肩病性关节炎、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征和红斑狼疮等。
[0015] HLA还在移植排斥中起主要作用。移植排斥的急性期可在约1-3周内发生并且通 常包括因宿主系统对供体I类和II类HLA分子的敏化而产生的宿主T淋巴细胞对供体组 织的作用。在大多数情况下，触发抗原是I类HLA。为了获得最佳的成功，针对HLA对供体 进行分型并尽可能完全地将其与患者受者匹配。但即使在家庭成员（其可共享高百分比的 HLA同一性）之间捐赠，通常仍然是不成功的。因此，为了保护受者内的移植组织，患者常常 必须经受深度的免疫抑制治疗，以防止排斥。这种治疗可导致因患者可能难以克服的机会 致病菌感染而引起的并发症和显著的病态。
[0016] 细胞疗法是其中将特定类型的细胞（例如，对肿瘤抗原具有反应性的T细胞或B 细胞）施予受者的特化类型的移植。细胞疗法可利用为自体的（来源于受者的）或同种异 体的（来源于供体的）细胞来进行，并且所述细胞可以是是未成熟细胞诸如干细胞，或完全 成熟的功能性细胞诸如T细胞。事实上，在某些疾病如某些癌症中，可离体操作T细胞来增 强它们对某些肿瘤抗原的亲合力，扩增其，随后将其引入患有该癌症类型的患者以试图根 除肿瘤。当内源性T细胞应答被肿瘤本身抑制时，这是特别有用的。然而，正如适用于关于 排斥的更加众所周知的实体器官移植一样，同样的警告适用于细胞疗法。供体T细胞表达 I类HLA抗原，并因此而能够引发来自受者的内源免疫系统的排斥应答。
[0017] 美国专利公布第2012/0060230号描述了经典HLA基因诸如HLA-A、HLA-B、HLA-C 的特异性锌指蛋白调节剂。这些调节剂可用于产生不表达一种或多种经典HLA基因的细胞 (例如，干细胞），并因此可用于自体移植物。然而，经典HLA表达的丢失可使经遗传修饰的 细胞能够成为基于KIR的配体的丢失的天然杀伤（NK)细胞介导的细胞毒性的靶。参见，例 如，Parham等（2005)NatRevImmunol. 5 (3): 201-214。
[0018] 因此，仍然需要对用于开发缺乏一些或所有经典HLA表达但细胞不被NK靶向而裂 解的细胞的组合物和方法。
[0019] 概述
[0020] 本文中公开了用于修饰HLA表达的方法和组合物。具体地，本文中提供了用于调 节HLA基因的表达以治疗HLA相关病症，例如与个体的HLA单体型相关的人病症的方法和 组合物。另外，本文中提供了用于删除（灭活）或抑制HLA基因以产生HLA无效的细胞、细 胞碎片（例如，血小板）、组织或完整生物，例如不表达一种或多种经典HLA基因的细胞的方 法和组合物。另外，这些方法和组合物可用于产生仅对于正好一个经典HLA基因，或不止一 个经典HLA基因无效的，或对于所有经典HLA基因完全无效的的癌细胞、细胞碎片、组织或 生物体。在某些实施方案中，经典HLA无效细胞或组织是对于在移植中的使用是有利的人 细胞或组织。
[0021] 因此，在一个方面，本文中描述了其中一种或多种经典HLA基因被灭活并且其中 一种或多种非经典HLA蛋白（例如，HLA-E、HLA-F、HLA-G)存在于细胞内的细胞。非经典I 类HLA分子可由内源基因表达（过表达），可被添加至细胞和/或可通过细胞铁遗传修饰来 表达（例如，表达一种或多种非经典HLA分子的多核苷酸的稳定或瞬时转染）。在某些实施 方案中，非经典HLA分子包含HLA-E和/或HLA-G。
[0022] 经修饰的细胞何以是淋巴样细胞（例如，天然杀伤（NK)细胞、T细胞、B细胞）、髓 样细胞（例如，单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、嗜碱粒细胞、肥大细胞）；干 细胞（例如，诱导多能干细胞（iPSC)、胚胎干细胞（例如，人ES)、间充质干细胞（MSC)、造血 干细胞（HSC)或神经元干细胞）或其碎片（例如，血小板）。干细胞可以全能或多能的（例 如，部分分化的，诸如为多能髓细胞样或淋巴样干细胞HSC)。在一些实施方案中，其中不止 一个经典HLA基因的表达已被改变的，一种或多种非经经典HLA的表达也被改变的经修饰 的细胞。在其它实施方案中，本发明提供了用于产生具有一种或多种或全部经典HLA基因 的无效表型的干细胞的方法。随后可将本文中描述的任何经修饰的干细胞（在HLA基因座 上经修饰）分化以产生为本文中描述的干细胞后代的分化的（体内或体外）细胞。
[0023] 在其它实施方案中，本文中描述了减少缺乏一种或多种经典HLA基因（例如，通过 一种或多种基因的核酸酶介导的灭活）的细胞的天然杀伤（NK)细胞裂解的方法，所述方法 包括提供如本文所述的细胞（例如，其中经典HLA基因被灭活并且其中一种或多种非经典 HLA分子存在的细胞），从而减少NK介导的细胞裂解。
[0024] 在另一个方面，本文中所述组合物（经修饰的细胞）和方法可用于例如治疗或预 防或改善任何HLA相关病症（即，与HLA单体型相关的）。所述方法通常包括（a)使用核 酸酶（例如，ZFN或TALEN)或具有工程化crRNA/tracrRNA的核酸酶体系诸如CRISPR/Cas 裂解分离的细胞（例如，T细胞或淋巴细胞）中的内源HLA基因或HLA调控基因，以便HLA 或HLA调控基因被灭活；(b)将非经典HLA分子引入细胞；和（c)将所述细胞引入受试者， 从而治疗或预防HLA相关病症。在某些实施方案中，所述HLA相关病症是移植物抗宿主病 (GVHD)。可将核酸酶作为mRNA、以蛋白质形式和/或作为编码核酸酶的DNA序列引入。同 样地，可将非经典HLA分子（例如，HLA-E和/或HLA-G)作为mRNA、以蛋白质形式和/或作 为编码核酸酶的DNA序列引入。在某些实施方案中，被引入受试者的分离的细胞还包含另 外的基因组修饰，例如整合的外源序列（至裂解的HLA或HLA调控基因或不同的基因，例如 安全港基因）和/或另外的基因诸如一种或多种TCR基因的灭活（例如，核酸酶介导的）。 可通过载体（例如Ad、AAV、LV)或通过使用技术诸如电穿孔引入外源序列。在一些方面，所 述组合物可包含分离的细胞碎片和/或分化的（部分或完全地）细胞。
[0025] 还提供了包含如本文中所述的经修饰的细胞（例如，具有灭活的经典HLA基因并 且表达非经典HLA基因的干细胞）的药物组合物。在某些实施方案中，所述药物组合物还 包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。此类药物组合物可被预防性或治疗性使用，并且 可包含1?3(：、1^5、15(：、批(：或其组合和/或衍生物。在其它实施方案中，提供了细胞、细胞 片段（例如，血小板）或来源于此类经修饰的干细胞的组织，以便必要时在HLA基因座中修 饰此类组织。在一些方面，此类细胞被部分分化（例如造血干细胞）然而在其它方面提供 了完全分化的细胞（例如淋巴细胞或巨核细胞），然而在其它方面，提供了分化的细胞的碎 片。在其它实施方案中，提供了可含有改变的HLA或HLA调控基因的它们的分化的后代，并 且它们还含有另外的遗传修饰，包括在另一个目标基因座上的供体DNA的缺失、改变或插 入。
[0026] 在一些实施方案中，如本文中所述的细胞可以是成熟细胞诸如CD4+T细胞或NK细 胞。在一些方面，所述成熟细胞可用于所有细胞疗法，例如用于T细胞移植。在其它实施方 案中，用于T细胞移植的细胞含有另一个目标基因修饰。在一个方面，所述T细胞含有插入 的对于癌症标志物是特异的嵌合抗原受体（CAR)。在其它方面，所述插入的CAR对于B细胞 恶性肿瘤的⑶19标志物特征是特异的。此类细胞可用于用于治疗患者而不必匹配HLA的 治疗性组合物，并且因此能够用作用于有此需要的任何患者的"下架"治疗剂。在一些方面， 提供了其中编码T细胞受体（TCR)基因（例如，TCRa和/或TCRi3链）的基因已被操作 或其中编码具有所需的特异性和亲和力的TCR链的基因已被引入的细胞。在其它实施方案 中，HLA经修饰的血小板被提供来治疗性用于治疗病症诸如血小板减少症或其它出血障碍。
[0027] 可在体外、体内和/或活体外实践本文中所述的任何方法。在某些实施方案中，活 体外实践所述方法例如以修饰干细胞、T细胞或NK细胞，随后用于治疗有此需要的受试者。
[0028] 总体上根据公开内容，这些和其它方面将对技术人员显而易见。
[0029] 附图简述
[0030] 图1，图框A和B，显示通过Surveyor?核酸酶测定评估的HLA-A3 (图1A)和 HLA-A2(图1B)的基因破坏的水平。较低（快速移动）的条带（箭头）是指示ZFN介导的 基因修饰的消化产物。条带底部的数字表示基于光密度测定法的的经修饰的HLA-A等位基 因的百分比。来自模拟转染的细胞和利用GFP表达载体转染的细胞的DNA用于阴性对照。
[0031] 图2,图框A和B，显示HLA-AnegHEK293的分离。图2A显示HLA-A2和HLA-A3蛋白 表达的丢失。亲代HEK293细胞和3个具有HLA-A丢失的衍生的经遗传修饰的克隆（编号为 18. 1、8. 18、83)上的HLA-A2和HLA-A3表达的流式细胞术分析。点线代表同种型（HLA-A2) 或SA-PE(HLA-A3)对照，实线代表无IFN-γ和TNF-a的HLA-A表达，并且填充线代表在用 600IU/mL的IFN-γ和10ng/mL的TNF-a培养48小时后HLA-A的表达。亲代栏中的虚线 代表EBV-LCL上的HLA-A2或HLA-A3表达。图2B显示HLA经修饰的克隆对CTL介导的裂 解的抗性。亲代HEK293和衍生的HLA-Aneg克隆与IFN-γ和TNF-a-起培养48小时，随后 用从ΡΑΝΕΙ(可选地着丝粒蛋白Μ同种型c)衍生的并且被CTL克隆7A7识别的同源HLA-A3 肽RVWDLPGVLK(SEQIDNO: 1，也见NP_001103685. 1)或从C190RF48/A2 衍生的并且被CTL克隆GAS2B3-5 识别的HLA-A2 肽CIPPDSLLFPA(SEQIDN0:2,也是NM_199250. 1 的可选择 的开放阅读框架）脉冲，随后在4小时的51Cr释放测定中以20:1的效应子对靶的比率评价 其被CTL克隆的识别。将表达PANElmHAg(未加载肽的）的HLA-A2+LCL(有阴影线的条块） 用作阳性对照。
[0032] 图3,图框A和B，显示在用ZFN进行的遗传编辑后在原代0KT3繁殖的T细胞上的 HLA-A表达的丢失。图3A(顶图框）显示在编码靶向HLA-A2的ZFN-L和ZFN-R的mRNA种 类（分别为SBS#18889和SBS#18881，见美国专利公布第20120060230号）电转移后HLA-A2 的细胞表面表达的丢失。在分级剂量的编码ZFN-L和ZFN-R的mRNA种类的电转移后4天 分析HLA-A2、CD4和CD8的共表达。对碘化丙啶阴性的活细胞群体的流式细胞术数据进行 门控。右下象限中的数目表示为HLA-Aneg的⑶4和⑶8+T的百分比。图3A(底图框）显示 增加的"冷激"对HLA-A表达的破坏。在分级剂量的编码ZFN-L和ZFN-R的mRNA种类的电 转移后4天收集数据。从ZFN的电转移后第1至3天在30°C培养细胞，随后返回37°C并再 培养一天，随后进行分析。图3B显示提高的融合于异二聚体FokI结构域变体的ZFN-L和 ZFN-R对HLA-A的破坏效率。将编码ZFN-L和ZFN-R异二聚体FokI突变体靶向HLA-A的 EL:KK的mRNA种类电转移至原代T细胞中。在将细胞于37°C培养4天，或在30°C培养3天 随后再在37°C培养1天后分析HLA-A2表达。X轴代表⑶4和⑶8表达，y-轴代表HLA-A2 表达。
[0033] 图4,图框A至C，显示非经典HLA分子的表达保护NK介导的细胞免于裂解。图 4A显示从来自健康供体（每一个供体被称为NK-1和NK-2)的两个单独PBMC分离的NK细 胞的免疫表型。针对PI_群体门控显示的流式细胞术数据。数字代表每一个上面的象限 的非分比。图4B显示表达HLA-E和/或HLA-G的HLAI类lm721.221细胞的遗传修饰。 SB转座子/转座酶用于在721. 221细胞的3个克隆中同源表达HLA-E和/或HLA-G。每 一个数字代表HLA-G、HLA-E或HLA-G和HLA-E两者的百分比表达，如通过流式细胞术检测 的。图4C显示由靶向721. 221的NK细胞产生的特异性裂解。NK细胞杀伤亲代（HLAI类 lm〇、HLA-E+、HLA-G+和HLA-E+HLA-G+721. 221细胞的相对能力。每一栏代表平均值土标准 差（SD)*。01〈Ρ〈0· 05, **Ρ〈· 01 ;和 ***Ρ〈· 001。
[0034] 图5,图框Α至C，显示在利用ZFN的遗传编辑后HLA-Aneg原代Τ细胞的富集。图 5Α显示HLA-A2negΤ-细胞群体的产生。HLA-A2negΤ细胞通过基于磁珠的选择来富集。显示 编码ZFN的mRNA的输入剂量和mRNA的电转移后的3天培养条件（37 °C相对30°C)。数字 代表⑶4和⑶8阳性群体内的HLA-A2阴性群体。图5B显示HLA-A2negT细胞的Surveyor? 核酸酶测定。针对HLA-A2表达的丢失富集的T细胞的分析显示通过快速移动条带（箭头） 的出现表示的HLA-A2基因座的破坏。图5C显示HLAnegT细胞的测序的结果（SEQIDN0:39 至53)。将使用HLA-A2-特异性引物从富集的细胞（2. 5μgZFN，EL:KKFokI结构域，30°C 处理）产生的PCR产物克隆进Τ0Ρ0载体（Invitrogen)，并且对质粒产物进行测序。野生型 序列列于顶上，预期的ZFN结合位点加以下划线。下面显示的是获自ZFN处理的并且被富 集的细胞的序列。缺失通过连字符来指示，序列变化以粗体突显。所有18个序列变化均导 致经预测阻止蛋白质翻译的框内移码。
[0035] 图6,图框A至C，显示利用ZFN遗传编辑的原代⑶19-特异性CAR+T细胞上的HLA-A 表达的丢失。图6A显示编码ZFN的mRNA的电转移对CAR+T细胞中的HLA-A2的破坏。将来 自HLA-A2+供体的T细胞电穿孔并繁殖以表达⑶19-特异性CAR(⑶19RCD28)。用2. 5μg 的每一种编码HLA-A-特异性ZFN的异二聚化FokI结构域变体（ZFN-L-EL和ZFN-R-KK) 的mRNA对这些T细胞进行重新电穿孔。在于30°C培养3天，随后在37°C培养1天后分析 HLA-A2表达。通过顺磁性选择进行HLA-A2neg群体的富集。图6B显示HLA-AnegCAR+T逃避由 HLA-A2限制的CTL产生的裂解。在于CRA中用作靶之前，用同源肽的系列稀释物脉冲指定的 CAR+T细胞的混合物。以20:1的效应子对靶的比率添加对于C190RF48/A2是特异的CTL克 隆GAS2B3-5。图6C显示经ZFN修饰的HLAnegCAR+T细胞维持所需的抗原特异性细胞毒性。 使用经遗传修饰以表达人⑶19的截短的变体的小鼠T细胞系EL4证明表达⑶19RCD28CAR 的HLA-AnegT细胞对⑶19的重定向特异性。EL4上引入的人⑶19的表达是100%。
[0036] 图7显示人ESC上的HLA-A表达的ZFN介导的消除。利用ZFN和编码抗生素抗性 的供体质粒修饰HLAA2+HLA-24+hES亲代细胞系WIBR3。选择具有HLA-A表达的丢失的克隆 (5230、5255、5258)，将其分化成成纤维细胞。在用600IU/mL的IFN-γ和10ng/mL的TNF-α 培养48小时后通过流式细胞术评估衍生的成纤维细胞上的HLA-A2和HLA-A24的表达。亲 代图中的虚线代表同种型对照。
[0037] 详述
[0038] 本文中公开了用于产生其中一种或多种经典HLA基因被灭活但表达一种或多种 非经典HLA基因的细胞的组合物和方法。以该方式靶向修饰的细胞可用作治疗剂，例如，移 植物，因为非经典HLA基因的存在减少或消除了HLA无效细胞的ΝΚ介导的裂解。另外，可 将其它目标基因插入其中HLA基因被操作的细胞中。
[0039] 因此，本文所述方法和组合物提供了治疗HLA相关病症的方法，并且这些方法和 组合物可包含能够调节靶基因的锌指转录因子以及工程化锌指核酸酶。
[0040] 概述
[0041] 除非另外指出，所述方法的实践以及本文公开的组合物的制备和使用采用 分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA和属于本 领域技术范围内的相关领域的常规技术。在文献中全面解释了这些技术。见，例如， Sambrook等，MOLECULARCL0NING:ALABORATORYMANUAL，第 2 版，ColdSpringHarbor LaboratoryPress, 1989 和第 3 版，2001;Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULAR BIOLOGY,JohnWiley&Sons，NewYork, 1987 和定期更新；METHODSINENZYM0L0GY系 列，A