在宿主基因组中，常常导致插入的转基因 长期表达。另外，已经在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
[0147] 可通过并入外源包膜蛋白，扩增靶细胞的潜在靶群体改变逆转录病毒的向性。慢 病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆 转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体由包装容量高达6-10kb外 源序列的顺式作用长末端重复组成。最小的顺式作用LTR足以复制和包装载体，然后用于 将治疗性基因整合到靶细胞中以提供永久性转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包 括基于小鼠白血病病毒（MuLV)、长臂猿白血病病毒（GaLV)、猿免疫缺陷病毒（SIV)、人免疫 缺陷病毒011￥)及其组合的那些（见，例如，811(*8(31^^等，1￥化〇1.66 :2731-2739(1992); Johann等，J.Virol. 66:1635-1640(1992);Sommerfelt等，Virol. 176:58-59(1990); Wilson等，J.Virol. 63:2374-2378(1989);Miller等，J.Virol. 65:2220-2224(1991) ;PCT/ US94/05700)。
[0148] 在其中优选瞬时表达的应用中，可使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体 在许多细胞类型中能够具有非常高的转导效率并不需要细胞分裂。用此类载体，已经 获得高滴度和高水平的表达。在相对简单的系统中可大量生成这种载体。腺相关病毒 ("AAV"）载体也用于例如在核酸和肽的体外生成中用核酸转导细胞，并且用于体内和活体 外基因治疗过程（见，例如，West等，Virology160:38-47(1987);美国专利第4, 797, 368 号；TO93/24641 ;Kotin，HumanGeneTherapy5:793-801(1994) ;Muzyczka，J.Clin. Invest. 94:1351 (1994)。在许多出版物中描述了重组AAV载体的构建，包括美国专利第 5,173,414 号；Tratschin等，Mol.Cell.Biol. 5: 3251-3260 (1985);Tratschin等，]?〇1· Cell.Biol. 4:2072-2081(1984);Hermonat和Muzyczka，PNAS81:6466-6470(1984);和 Samulski等，J.Virol. 63:03822-3828 (1989)。
[0149] 至少6种病毒载体方法目前可用于临床试验中的基因转移，其利用牵涉由插入辅 助细胞系中的基因互补缺陷型载体的方法以生成转导剂。
[0150] pLASN和MFG-S为已经用于临时试验的逆转录病毒载体的实例（Dunbar等， Blood85:3048-305(1995);Kohn等，Nat.Med. 1:1017-102(1995);Malech等，PNAS94:22 12133-12138(1997))。PA317/pLASN为用于基因治疗试验的首例治疗性载体。（B1aese 等，Science270:475-480(1995))。对于MFG-S包装载体已经观察到50 %或更高的转 导效率。（Ellem等，ImmunolImmunother. 44 (1) : 10-20 (1997);Dranoff等，Hum.Gene Ther. 1:111-2(1997)〇
[0151] 重组腺相关病毒载体（rAAV)是基于缺陷型和非病原性细小病毒腺相关2型病毒 的有前景的可供选择的基因递送系统。所有载体源自仅保留了在转基因表达盒两侧的AAV 145bp反向末端重复的质粒。由于整合到转导细胞基因组中的有效基因转移和稳定的转基 因递送是这种载体系统的关键特征。（Wagner等，Lancet351:9117 1702-3(1998)，Kearns 等，GeneTher. 9:748-55 (1996))。也可根据本发明使用其它AAV血清型，包括AAV1、AAV3、 AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV8. 2、AAV9 和AAVrhlO及假型AAV例如AAV2/8、AAV2/5 和 AAV2/6〇
[0152] 复制缺陷型重组腺病毒载体（Ad)可在高滴度下生成并且容易感染许多不同细胞 类型。大部分腺病毒载体经工程化，以致转基因置换AdEla、Elb和/或E3基因；随后使复 制缺陷型载体在反式供给缺失基因功能的人293细胞中增殖。Ad载体可在体内转导多种类 型的组织，包括非分裂、分化细胞例如存在于肝脏、肾脏和肌肉中的细胞。常规Ad载体承载 容量大。临床试验中使用Ad载体的实例包括经肌肉内注射进行抗肿瘤免疫的多核苷酸疗 法（Sterman等，Hum.GeneTher. 7:1083-9(1998))。在临床试验中使用腺病毒载体进行基因 转移的另外实例包括Rosenecker等，Infection24:1 5-10(1996);Sterman等，Hum.Gene Ther. 9:7 1083-1089(1998);Welsh等，Hum.GeneTher. 2:205-18(1995);Alvarez等，Hum. GeneTher. 5:597-613 (1997);Topf等，GeneTher. 5:507-513 (1998) ;Sterman等，Hum.Gene Ther. 7:1083-1089(1998)〇
[0153] 包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒粒子。此类细胞包括包装腺病毒的 293细胞和包装逆转录病毒的Φ2细胞或PA317细胞。通常由将核酸载体包装在病毒粒子 中的生产细胞系生成用于基因治疗的病毒载体。所述载体通常含有包装和后续整合到宿主 (若适用）所需的最小病毒序列，由编码待表达蛋白质的表达盒置换的其它病毒序列。由包 装细胞系反式供给缺少的病毒功能。例如，用于基因治疗的AAV载体通常仅仅具有来自于 AAV基因组的包装和整合到宿主基因组中所需的反向末端重复（ITR)序列。病毒DNA包装 在含有编码其它AAV基因，即r印和cap的辅助质粒，但是缺乏ITR序列的细胞系中。细胞 系还受作为辅助因子的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和AAV基因由辅助质粒 表达。由于缺乏ITR序列，辅助质粒未大量包装。例如，可通过腺病毒比AAV更敏感的热处 理减轻受腺病毒的污染。
[0154] 在许多基因治疗应用中，以对特定组织类型的高度特异性，递送基因治疗载体是 可取的。相应地，可通过表达配体作为与病毒外表面上的病毒外壳蛋白的融合蛋白，将病毒 载体修饰为对指定细胞类型具有特异性。选择所述配体对已知存在于目标细胞类型上的受 体具有亲和力。例如，Han等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:9747-9751(1995)报道可将莫 洛尼鼠白血病病毒修饰为表达与gp70融合的人调蛋白（heregulin)，并且重组病毒感染表 达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。这种原理可延伸到其它病毒-靶细胞对，其 中靶细胞表达受体而病毒表达包含细胞表面受体的配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体可 经工程化为展示对几乎所选任何细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段（例如，FAB 或Fv)。虽然以上描述主要适用于病毒载体，但是可将相同原理应用于非病毒载体。此类载 体可经工程化为含有利于被特定靶细胞摄取的特定摄取序列。
[0155] 可通过向患者个体施用，通常通过如下所述的全身施用（例如，静脉内、腹膜内、 肌肉日、皮下或颅内输注）或局部应用，在体内递送基因治疗载体。可选地，可在活体外向 细胞，例如从患者个体移植的细胞（例如淋巴细胞、骨髓穿刺液、组织活检）或万能供血者 造血干细胞递送载体，接着通常在为已经并入载体的细胞选择后，将细胞再植入患者体内。
[0156] 用于诊断、研究、移植或基因治疗的活体外细胞转染（例如，通过将转染细胞再次 输注到宿主生物中）为本领域的技术人员众所周知。在一个优选实施方案中，从受试生物 分离细胞，用DNA结合蛋白的核酸（基因或cDNA)转染，并且再次输注至受试生物（例如， 患者）体内。适合活体外转染的各种细胞类型为本领域的技术人员众所周知（见，例如， Freshney等，CultureofAnimalCells，AManualofBasicTechnique(1994年第3版）） 和本文引用以讨论如何从患者分离和培养细胞的参考文献）。
[0157] 在一个实施方案中，干细胞用于细胞转染和基因治疗的活体外过程。使用干 细胞的优点是它们可在体外分化为其它细胞类型，或可引入哺乳动物（例如细胞供 体）中，在这里它们将植入骨髓中。已知使用细胞因子例如GM-CSF、IFN-y和TNF-a 使CD34+细胞在体外分化成临床上重要的免疫细胞类型的方法（见Inaba等，J.Exp. Med.176:1693-1702(1992))。
[0158] 使用已知方法分离干细胞进行转导和分化。例如，通过用结合不必要的细 胞，例如⑶4+和⑶8+ (T细胞）、⑶45+ (panB细胞）、GR-1 (粒细胞）和lad(分化的抗 原呈递细胞）的抗体，淘选骨髓细胞，而从骨髓细胞分离干细胞（见Inaba等，J.Exp. Med.176:1693-1702(1992))。
[0159] 在一些实施方案中也可使用已经修饰的干细胞。例如，已经使其抗细胞凋亡的神 经元干细胞可用作治疗组合物，其中干细胞还含有本发明的ZFPTF。例如，通过在干细胞中 使用ΒΑΧ-或BAK-特异性ZFN(见，美国专利申请第12/456, 043号）或在半胱天冬酶中破 坏的干细胞中，例如再次使用半胱天冬酶-6特异性ZFN敲除ΒΑΧ和/或ΒΑΚ，可能出现对细 胞凋亡的抗性。可用已知调控HLA的ZFPTF转染这些细胞。
[0160] 也可向生物直接施用含有治疗性DNA结合蛋白（或编码这些蛋白的核酸）的载体 (例如，逆转录病毒、腺病毒、脂质体等）以在体内进行细胞转导。可选地，可施用裸DNA。 通过一般用于将分子引入与血液或组织细胞的最终接触的任何途径施用，包括但不限于注 射、输注、局部应用和电穿孔。施用此类核酸的适合方法可用并且为领域的技术人员众所周 知，并且，虽然可使用一种以上的途径施用特定组合物，但是常常一种特定途径可以提供比 另一途径更直接且更有效的反应。
[0161] 例如，在美国专利第5, 928, 638号中公开了将DNA引入造血干细胞的方法。用于 将转基因引入造血干细胞，例如⑶34+细胞的载体包括35型腺病毒。
[0162] 适合将转基因引入免疫细胞（例如，T细胞）的载体包括非整合慢病毒载 体。见，例如，〇ry等（1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382-11388;Dull等（1998) J.Virol. 72:8463-8471;Zuffery等（1998)J.Virol. 72:9873-9880;Follenzi等（2000) NatureGenetics25:217-222。
[0163] 部分由施用的特定组合物以及由用于施用组合物的特定方法决定药学上可接受 的载体。相应地，如下所述，存在可用药物组合物的多种适合配方（见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences，第 17 版，1989)〇
[0164] 如上所述，公开的方法和组合物可用于任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、 真菌细胞、古细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞和人 细胞，包括任何类型的T细胞和干细胞。用于蛋白质表达的适合细胞系为本领域的技术人 员已知并且包括但不限于COS、CH0(例如，CH0-S、CH0-K1、CH0-DG44、CH0-DUXB11)、VER0、 MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Agl4、HeLa、HEK293 (例如，HEK293-F、 HEK293-H、HEK293-T)、perC6、昆虫细胞例如草地贪夜蛾（Sf)和真菌细胞例如酵母属，毕赤 酵母和裂殖酵母。也可使用这些细胞系的子代、变体和衍生物。
[0165] 应用
[0166] 公开的组合物和方法可用于其中需要调节HLA表达和/或功能性的任何应用，包 括但不限于其中HLA调节是所需的治疗和研究应用。
[0167] 与HLA密切相关的疾病和病况包括阿狄森氏病、强直性脊柱炎、白塞氏病、伯格氏 病、乳糜泻、慢性活动性肝炎、格雷夫斯病、幼年型类风湿关节炎、银肩病、银肩病性关节炎、 类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征和红斑狼疮等。另外，HLA基因的调节可与目标细胞的其 它遗传修饰结合使用。例如，可将利用嵌合抗原受体对靶细胞诸如CTL的修饰（以改变CTL 的特异性）与如本文所述的活体外HLA修饰组合，以开发可用于大多数有此需要的任何患 者的细胞治疗。
[0168] 另外，本发明的材料和方法可用于治疗、预防或改善移植物抗宿主病。当向患者施 用同种异体T细胞（例如，骨髓和/或输血）时，移植物抗宿主病（GVHD)是常见并发症。输 注的材料中的功能性免疫细胞将受者识别为"外来物"并且激发免疫攻击。通过调节同种 异体T细胞中的HLA和/或TCR表达，可将"下架"T细胞（例如，⑶19-特异性T细胞）作 为"药物"按需施用，因为GVHD的风险下降或被消除并且，另外地，非经典HLA分子的提供 减少或消除经修饰的细胞的NK介导的裂解。
[0169] 方法和组合物还包括其中干细胞内的一种或多种经典HLA基因已被灭活并且一 种或多种非经典HLA分子被激活的干细胞组合物。例如，已将HLA经修饰的造血干细胞引 入骨髓去除后的患者。这些改变的HSC可允许患者的再定殖而无因排斥和/或NK介导的 细胞裂解产生的丢失。引入的细胞还可具有其它改变来在随后的治疗（例如，化学疗法抗 性）过程中帮助治疗基础疾病。
[0170] 本发明的方法和组合物也用于HLA经修饰的血小板（例如用作治疗剂）的开发。 因此，HLA经修饰的血小板可用于治疗血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫癜、血栓性 血小板减少性紫癜和药物诱发的血小板减少性紫癜（例如，肝素诱发的血小板减少症）。可 用本发明的HLA经修饰的血小板治疗的其它血小板病症包括戈谢病、再生障碍性贫血、奥 尼赖病、胎儿母亲异源免疫性血小板减少症、HELLP综合征、癌症以及来自一些化疗治疗剂 的副作用。HLA经修饰的血小板还作为"下架"疗法在急诊室情况下用于创伤患者。
[0171] 本发明的方法可用于异种移植术。具体地，仅通过举例，可将猪的器官用于移植进 人中，其中猪类MHC基因已被删除和/或被人HLA基因置换。可开发（从已具有由被注射 入它们的mRNA编码的靶向HLA的ZFN以便内源MHC基因被破坏的猪胚胎，或从使用它们的 HLA基因已被成功地靶向的细胞的细胞核将体细胞的细胞核转移进猪胚胎）含有这些有用 的基因突变的猪的品系，并将可培养这些动物直至最终器官收获。这将在人中阻止对这些 器官的排拆和增加成功移植的机会。
[0172] 本发明的方法和组合物还用于设计和实现体外和体内模型，例如，允许研究这些 病症的HLA或其它病症的动物模型。 实施例
[0173] 实施例1:材料和方法
[0174] ZFN
[0175] 使用如美国专利第20120060230号中所述的已预先验证的2-指和1-指模块的的 已建立的档案设计和组装含有5或6个指的HLA-A结合ZFN。可使用的示例性ZFN示于下 表1中。该表中的第1栏是ZFP的内部参照名称（编号）并且对应于表2的第1栏中的相 同名称。"F"指的是指并且"F"后的数字是指哪个锌指（例如，"F1"指的是指1)。
[0176] 表1:锌指蛋白
[0177]
[0178] 表2中公开了示例性HLA-A结合蛋白的靶位点的序列。表2显示指定的锌指蛋白 的靶序列。被ZFP识别螺旋接触的靶位点中的核苷酸以大写字母指示；非接触核苷酸以小 写字母指示。
[0179] 表2:HLA-A锌指靶位点
[0180]
[0181] 细胞培养
[0182] 将册1(293细胞维持在补充有10%热灭活胎牛血清$83丄〇1^&)和2臟〇1/ LL-谷氨酰胺（Glutamax_l:Invitrogen,Carlsbad,CA)的达尔伯克改良伊格尔培养 基（Lonza,Basel,Switzerland)中。将EBV-LCU721. 221 和EL-4 细胞系维持在补充有 10%热灭活的FBS和2mmol/LL-谷氨酰胺的RPMI1640(Lonza)中。这些细胞系的鉴 定通过STRDNA指纹分析来确认。对于mHAg是特异的⑶8+CTL克隆是：在HLA-A*0301 的背景中的识别由ΡΑΝΕΙ编码的肽RVWDLPGVLK(SEQIDN0:1)的克隆7A7(Brickner等 (2006)Blood107(9) :3779-3786)和识别来自C190RF48 中的 0RF+2/48 的HLA-A*0201-限 制的CIPH)SLLFPA(SEQIDN0:2,NM_199250. 1的可选的开放阅读框架）肽的克隆 GAS2B3-5(Tykodi等（2008)ClinCancerRes. 14 (16): 5260-5269)。在 51 铬释放测定前一 天解冻(：11克隆，将其维持在补充有10%人白蛋白血清、2臟〇1/1^-谷氨酰胺、2〇1^/1^的 IL_15(PeproTech，RockyHill,NJ)和 20IU/mL的IL-2(Chiron,Emeryville,CA)的RPMI 1640 中。
[0183] 载有0KT3的人工抗原呈递细胞（aAPC)对原代T细胞的激活
[0184] 通过在补充有2mmol/LL-谷氨酰胺和10%FBS以及50IU/mL的IL-2的RPMI 1640(始于aAPC添加后第二天，每隔一天添加的）中以1:1(T细胞：γ-辐照的（100Gy) aAPC)的比率用加载至aAPC(克隆#4 :通常经修饰稳定地共表达⑶19、⑶64、⑶86、 CD137L和与EGFP17同步表达的白细胞介素IL-15的膜结合的突变蛋白的K562细胞（见， O'Connor等（2012)SciRep2:249;Manuri等（2010)HumGeneTher21(4):427-437))上 的 0KT3(eBioscience，SanDiego，CA)刺激PBMC，来通过体外交联CD3 激活T细胞（CARneg) 以使其持续增殖。每14天再添加载有0KT3的aAPC-次以持续T细胞增殖。
[0185] 经遗传修饰的⑶19-特异性CAR+T细胞的产生和在⑶19+aAPC上的增殖
[0186] 我们制造临床级CAR+T细胞的方法经改造适合于产生⑶19-特异性T细胞。（见， 例如，Singh等（2008)CancerRes. 68(8) :2961-2971)。使用NucleofectorII装置（Lonza) 将编码SB转座子CD19RCD28和SB极度活跃的转座酶SB11的DNA质粒同时电转移（人T 细胞细胞核转染溶液，程序U-014)进来源于PBMC的T细胞。通过在50IU/mL的IL-2 (始 于aAPC添加后第二天，每隔一天添加）存在的情况下，在电穿孔当天添加以及每隔14天再 添加（以1:2的T细胞：aAPC比率）γ-辐照的（100Gy)aAPC(无0KT3加载的克隆#4)来 选择性地在数目上扩增一组CAR+T细胞。
[0187] 信使RNA的体外转录
[0188] 如先前Torikai等（2012)Blood119(24) :5697-5705 中所述制备体外转录的mRNA 种类。简言之，用Xhol线性化编码ZFN-L和ZFN-R的DNA模板质粒。在按照制造商的说明 书体外转录（RiboMAX?大规模RNA产生系统-T7,Promega，Madison,WI)和加帽（ARCA帽类 似物，Ambion,Austin,TX)后，使用polyA加尾试剂盒（Ambion)添加多聚腺噪呤酸。在1% 变性琼脂糖凝胶上利用3-(N-吗啉代）丙烷磺酸（MOPS)缓冲液验证mRNA种类的完整性，并 通过分光光度计（BioRad，Hercules，CA)在0D260测定浓度。将mRNA装入小瓶并于-80°C 贮存以用于一次性使用。
[0189] 编码ZFN的DNA质粒和mRNA种类的电穿孔
[0190] 为了修饰HEK293细胞，使用制造商的方案通过核转染法（Lonza)引入编码靶向 HLA-A的ZFN的表达载体。在初始刺激后6天或在用γ-辐照的aAPC再刺激后2至3天 收获T细胞。将500万个T细胞与2. 5至10μg的每一种ZFN-L和ZFN-RmRNA种类于 100μL的人T细胞细胞核转染溶液（Lonza)预混合，随后使用NucleofectorII设备利用 程序T-20在电击杯中进行电穿孔。在电穿孔后，立即将细胞置于预先加温的补充有2mmol/ LL-谷氨酰胺和10%FBS的RPMI1640中，并在37°C和5%C02下培养4-6小时，在该点 上添加50IU/mL的IL-2以进一步培养。在"冷激"实验中，在于37°C-5%C02培养箱中培 养过夜后，将T细胞转移至30°C、5%C02培养箱中，并培养3天，随后在进行分析之前返回 37°C、5%C02 培养箱。
[0191] 缺少HLA-A的表达的细胞的富集
[0192] 在用补充有2%FBS和2mMEDTA的磷酸盐缓冲盐水（PBS)洗涤细胞后，在4°C用缀 合有PE的单克隆抗体（mAb)特异性抗_HLA_A2(BDBiosciences，SanJose，CA)标记细胞， 进行15分钟，随后洗涤，然后并用抗-PE微珠（MiltenyiBiotec,Auburn,CA)标记10分钟。 洗涤后，将标记的细胞通过LD柱（MiltenyiBiotec)，收集流过级分，并进行培养。将T细胞 在γ-辐照的加载有0KT3的aAPC上繁殖，并且将CAR+T细胞在⑶19+aAPC(未加载0KT3 的）上于补充有2mmol/LL-谷氨酰胺和10%FBS及50IU/mL的IL-2的RPMI1640 (每隔 一天添加）中繁殖。
[0193] 流式细胞术
[0194] 使用以下抗体：藻红蛋白（PE)抗HLA-A2 (克隆BB7. 2