域的结合特异性的增强。
[0088] 靶位点的选择、ZFP和设计和构建融合蛋白（和编码融合蛋白的多核苷酸） 的方法为本领域的技术人员已知并且在美国专利第6, 140, 0815、789, 538、6, 453, 242、 6, 534, 261、5, 925, 523、6, 007, 988、6, 013, 453、6, 200, 759 号、TO95/19431、TO96/06166、 TO98/53057、TO98/54311、TO00/27878、TO01/60970、TO01/88197、TO02/099084、TO 98/53058、TO98/53059、TO98/53060、TO02/016536 和TO03/016496 中有详细描述。
[0089] 另外，如这些和其它参考文献中所公开那样，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可 使用任何适合接头序列，包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头连接在一起。对于 长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头，同样见美国专利第6, 479, 626、6, 903, 185和 7, 153, 949号。本文所述蛋白质可包括在蛋白质的单独锌指之间适合接头的任何组合。
[0090] 在某些实施方案中，DNA结合结构域为结合（以序列特异性方式）结合HLA基因或 HLA调控基因中的靶位点并且调节HLA的表达的工程化锌指蛋白。ZFP可选择性结合特定的 目标单体型。关于美国群体中鉴定的HLA单体型以及根据人种的其频率的论述，见Maiers 等（2007)HumanImmunology68:779-788(通过引用并入本文）。
[0091] 另外，提供了结合功能性HLA调控基因（包括但不限于Tapi、Tap2、Tapascin、 CTFIIA，和RFX5)的ZFP。HLA靶位点通常包括至少一个锌指但可包括多个锌指（例如，2、 3、4、5、6或更多个指）。通常地，ZFP包括至少3个指。某些ZFP包括4、5或6指。包括3 指的ZFP通常识别包括9或10个核苷酸的靶位点；包括4指的ZFP通常识别包括12至14 个核苷酸的靶位点；而具有6指的ZFP可识别包括18至21个核苷酸的靶位点。ZFP还可 以是融合蛋白，其包括一个或多个调控结构域，所述结构域可以是转录激活或阻遏结构域。
[0092] ZFP的特定实例公开于美国专利公布第20120060230号中的表1中。
[0093] 在一些实施方案中，DNA结合结构域可源自核酸酶。例如，已知归巢内切核酸酶 和大范围核酸酶的识别序列，例如I-Scel、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、 I-PanI、I-SceII、I-Ppol、I-SceIII、I-Crel、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。还见美 国专利第 5, 420, 032 号、美国专利第 6, 833, 252 号；Belfort等（1997)NucleicAcids Res. 25:3379 - 3388;Dujon等（1989)Gene82:115-118;Perler等（1994)NucleicAcids Res. 22, 1125 - 1127 ;Jasin(1996)TrendsGenet. 12:224 - 228;Gimble等（1996)了.]?〇1· Biol. 263:163 - 180;Argast等（1998)J.Mol.Biol. 280:345 - 353 和NewEnglandBiolabs 目录。另外，归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可经工程化为结合非天然 革巴位点。见，例如，Chevalier等（2002)Molec.Cell10:895-905;Epinat等（2003)Nucleic AcidsRes.31:2952-2962;Ashworth等（2006)Nature441:656-659;Paques等（2007) CurrentGeneTherapy7:49-66;美国专利公布第 20070117128 号。
[0094] 在其它实施方案中，DNA结合结构域包含来自与来源于植物病原菌黄单孢 菌属（Xanthomonas)(见Boch等，（2009)Science326:1509-1512 以及Moscou和 Bogdanove, (2009)Science326:1501)和罗尔斯通氏菌属（Ralstonia)(见Heuer等 (2007)AppliedandEnvironmentalMicrobiology73(13):4379-4384);美国专利申请 第20110301073和20110145940号）的那些效应子相似的TAL效应子的工程化结构域。 已知黄单孢菌属的植物病原菌在重要作物中引起许多疾病。黄单孢菌属的病原性取决于 向植物细胞注入25种以上不同效应子蛋白的保守型III分泌（T3S)系统。其中注入的 蛋白质为模拟植物转录激活因子并且操纵植物转录组的转录激活因子样效应子（TALE) (见Kay等（2007)Science318:648-651)。这些蛋白质含有DNA结合结构域和转录激 活结构域。表征最清楚的TALE之一为来自野油菜黄单胞菌疱病致病变种（Xanthomonas campestgrispv.Vesicatoria)的AvrBs3(见Bonas等（1989)MolGenGenet218:127-136 和TO2010079430)。TALE含有串联重复的集中式结构域，每个重复含有对这些蛋白质的DNA 结合特异性关键的大约34个氨基酸。另外，其含有核定位序列和酸性转录激活结构域（对 于综述，见SchornackS等（2006)JPlantPhysiol163 (3): 256-272)。另外，在植物病原细 菌青枯病菌（Ralstoniasolanacearum)中，已经发现在青枯病菌（R.solanacearum)生物 变种1菌株GMI1000和生物变种4菌株RS1000中称为brgll和hpxl7的两个基因与黄单孢 菌属的AvrBs3 家族同源（见Heuer等（2007)ApplandEnvirMicro73(13):4379_4384)〇 这些基因在核苷酸序列上98. 9%彼此相同，但是不同之处在于hpxl7的重复结构域中缺失 1，575bp。然而，两种基因产物与黄单孢菌属的AvrBs3家族蛋白具有低于40%的序列同一 性。
[0095] 另外，如这些和其它参考文献中公开的，可使用任何合适的接头序列，包括例如在 长度上具有5或更多个氨基酸的的接头来将锌指结构域和/或多指化锌指蛋白或TALE连 接在一起。关于例如长度为6或更多个氨基酸的示例性接头，也见，美国专利第6, 479, 626、 6, 903, 185和7, 153, 949号。本文所述蛋白质可包括蛋白质的单独锌指之间的合适的接 头的任意组合。另外，对于锌指结合结构域的结合特异性的增强已描述于例如美国专利第 6, 794, 136 号中。
[0096] 融合蛋白
[0097] 还提供了包含如本文所述的DNA结合蛋白（例如，ZFP或TALE)和异源调控（功 能）结构域（或其功能片段）的融合蛋白。常见结构域包括（例如）转录因子结构域（激 活因子、阻遏因子、辅助激活因子、辅助阻遏因子）、沉默子、致癌基因（例如，myc、jun、f〇s、 myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成员等）；DNA修复酶及其相关因子和修饰因 子；DNA重排酶及其相关因子和修饰因子；染色质相关蛋白及其修饰因子（例如，激酶、乙 酰基转移酶和脱乙酰基酶）；和DNA修饰酶（例如，甲基转移酶、拓扑异构酶、解螺旋酶、连 接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、内切核酸酶）及其相关因子和修饰因子。关于DNA结合结构 域和核酸酶裂解结构域融合的详情，见美国专利申请公布第20050064474、20060188987和 2007/0218528号，其通过引用整体并入本文。
[0098] 用于实现激活的适合结构域包括HSVVP16激活结构域（见，例如Hagmann 等，J.Virol. 71，5952-5962 (1997))核激素受体（见，例如Torchia等，Curr. Opin.Cell.Biol. 10:373-383(1998));核因子κΒ的p65 亚基（Bitko和Barik， J.Virol. 72:5610-5618 (1998)及Doyle和Hunt，Neuroreport8:2937-2942(1997)); Liu等，CancerGeneTher. 5:3-28(1998))或人工嵌合功能结构域例如VP64(Beerli等， (1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:14623-33)和降解决定子（Molinari等，（1999)ΕΜΒ0 J. 18,6439-6447)。另外的示例性激活结构域包括Oct1、0(^-24、3?1^?-2和〇^1(361?61 等，ΕΜΒ0J. 11，4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRClPvALF、AtHD2A和ERF-2。 见，例如，Robyr等（2000)Mol.Endocrinol. 14:329-347;Collingwood等（1999)J.Mol. Endocrinol. 23:255-275;Leo等（2000)Gene245:1-11 ;ManteufTel-Cymborowska(1999) ActaBiochim.Pol. 46:77-89;McKenna等（1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol. 69:3-12; Malik等（2000)TrendsBiochem.Sci. 25:277-283;和Lemon等（1999)Curr.0pin· Genet.Dev. 9:499-504。另外的示例性激活结构域包括但不限于OsGAI、HALF-1、Cl、 API、ARF-5、-6、-7、和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1。见，例如，Ogawa等 (2000)Gene245:21-29 ;0kanami等（1996)GenesCells1:87-99;Goff等（1991)Genes Dev. 5:298-309;Cho等（1999)PlantMol.Biol. 40:419-429;Ulmason等（1999)Proc. Natl.Acad.Sci.USA96:5844-5849 ;Sprenger_Haussels等（2000)PlantJ. 22:1-8; Gong等（1999)PlantMol.Biol. 41:33-44 ;和Hobo等（1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15, 348-15, 353。
[0099] 对于本领域的技术人员而言，明确的是在DNA结合结构域和功能结构域之间的融 合蛋白（或编码融合蛋白的核酸）的形成中，激活结构域或与激活结构域相互作用的分子 适合作为功能结构域。基本上能够为靶基因募集激活复合物和/或激活活性（例如，组蛋白 乙酰化）的任何分子均可用作融合蛋白的激活结构域。例如在美国专利申请2002/0115215 和2003/0082552及W0 02/44376中描述了适合用作融合分子中的功能结构域的绝缘子结 构域、定位结构域和染色质重构蛋白例如含ISWI的结构域和/或甲基结合结构域蛋白。
[0100] 示例性阻遏结构域包括但不限于KRABΑ/Β、Κ0Χ、TGF-β-诱导型早期基因 (TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族成员（例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、1? 和 MeCP2。见，例如，Bird等（1999)Cell99:451-454;Tyler等（1999)Cell99:443-446; Knoepfler等（1999)Cell99:447-450 ;和Robertson等（2000)NatureGenet. 25:338-342。 另外的示例性阻遏结构域包括但不限于R0M2和AtHD2A。见，例如，Chem等（1996)Plant Cell8:305-321 ;和Wu等（2000)PlantJ. 22:19-27。
[0101] 通过本领域技术人员众所周知的克隆和生物化学偶联方法构建融合分子。融合分 子包含DNA结合结构域和功能结构域（例如，转录激活或阻遏结构域）。融合分子还任选包 含核定位信号（例如，来自SV40基质T抗原）和表位标签（例如，FLAG和血细胞凝集素）。 设计融合蛋白（和编码融合蛋白的核酸），以便将翻译阅读框保存在融合组成部分中。
[0102] 通过本领域技术人员众所周知的生物化学偶联方法构建一只手上功能结构域 (或其功能片段）的多肽组成部分与另一只手上非蛋白DNA结合结构域（例如，抗生素、嵌 入剂、小沟结合剂、核酸）之间的融合。见，例如，PierceChemicalCompany(Rockford,IL) 目录。已经描述了用于在小沟结合剂与多肽之间产生融合的方法和组合物。Mapp等（2000) Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:393〇-3935〇
[0103] 在某些实施方案中，由锌指蛋白结合的靶位点存在于细胞染色质的可达区域。例 如，可如美国专利第7, 217, 509和7, 923, 542号中所述测定可达区域。如果靶位点不存在 于细胞染色质的可达区域，可如美国专利第7, 785, 792和8, 071，370号中所述生成一个或 多个可达区域。在另外的实施方案中，融合分子的DNA结合结构域能够与细胞染色质结合， 不管其靶位点是否在可达区域内。例如，此类DNA结合结构域能够与接头DNA和/或核小 体DNA结合。在某些类固醇受体和肝细胞核因子3 (HNF3)中发现这类"先锋"DNA结合结构 域的实例。Cordingley等（1987)Cell48:261-270;Pina等（1990)Cell60:719-731;和 Cirillo等（1998)EMB0J. 17:244-254。
[0104] 如本领域的技术人员所知，融合分子可与药学上可接受的载体配制。见，例如， Remington'sPharmaceuticalSciences，第 17 版，1985 ;和美国专利第 6, 453, 242 和 6, 534, 261 号。
[0105] 融合分子的功能组成部分/结构域可选自一旦融合分子经由其DNA结合结构域与 靶序列结合，就能够影响基因转录的多种不同组成部分。因此，功能组成部分可包括但不限 于各种转录因子结构域，例如激活因子、阻遏因子、辅助激活因子、辅助阻遏因子和沉默子。
[0106] 例如，在美国专利第6, 534, 261和6, 933, 113号中公开了另外的示例性功能结构 域。
[0107] 也可选择受外源小分子或配体调控的功能结构域。例如，可采用RheoSwitch? 技术，其中功能结构域只有在外部RheoChem?配体的存在下呈现其活性构象（见例如US 20090136465)。因此，ZFP可与可调控的功能结构域可操作地连接，其中所产生的ZFP-TF活 性受外部配体控制。
[0108] 核酸酶
[0109] 在某些实施方案中，融合蛋白包含DNA结合结构域和裂解（核酸酶）结构域。同 样，可使用核酸酶，例如工程化核酸酶实现基因修饰。工程化核酸酶技术基于天然存在的 DNA结合蛋白的工程化。例如，已经描述了具有定制DNA结合特异性的归巢内勤核酸酶的 工程化。（Chames等（2005)NucleicAcidsRes33(20):el78;Arnould等（2006)J.M〇1. Biol. 355:443-458)。另外，还已经描述了ZFP的工程化。见，例如，美国专利第6, 534, 261、 6, 607, 882、6, 824, 978、6, 979, 539、6, 933, 113、7, 163, 824 和 7, 013, 219 号。
[0110] 另外，ZFP和/或TALE已经与核酸酶结构域融合以产生能够通过其经工程化的 (ZFP或TALE)DNA结合结构域识别其预期核酸靶标并经由核酸酶活性引起在DNA结合位点 附近裂解DNA的ZFN和TALEN-功能实体。见，例如，Kim等（1996)ProcNat'lAcadSciUSA 93(3) : 1156-1160。最近，此类核酸酶已经用于多种生物中的基因组修饰。见，例如，美国专 利公布 20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231 和国际公布W0 07/014275。
[0111] 因此，本文所述的方法和组合物广泛适用并且可能牵涉任何目标核酸酶。核酸酶 的非限制性实例包括大范围核酸酶、TALEN和锌指核酸酶。核酸酶可能包含异源DNA结合 和裂解结构域（例如，锌指核酸酶；大范围核酸酶DNA结合结构域与异源裂解结构域），或 可选地，天然存在的核酸酶的DNA结合结构域可改变为与所选靶位点结合（例如，已经工程 化为与不同于同源结合位点的位点结合的大范围核酸酶）。
[0112] 在本文所述的任何核酸酶中，所述核酸酶可包含工程化TALEDNA结合结构域和核 酸酶结构域（例如，内切核酸酶和/或大范围核酸酶结构域），也称为TALEN。用于工程化这 些TALEN蛋白以与用户选择的靶序列发生强劲的位点特异性相互作用的组合物已被公布 (见，美国专利第8, 586, 526号）。在一些实施方案中，所述TALEN包含内切核酸酶（例如， FokI)裂解结构域或裂解半结构域。在其它实施方案中，所述TALE核酸酶是大范围TAL。这 些大范围TAL核酸酶是包含TALEDNA结构值勤玫大范围核酸酶裂解结构域的融合蛋白。大 范围核酸酶裂解结构域作为单体是有活性的并且不需要二聚化俨产生活性。（见Boissel 等，（2013)NuclAcidRes: 1-13,doi:10. 1093/nar/gktl224)。另外，核酸酶结构域还可展 示DNA结合功能性。
[0113] 在另外的实施方案中，所述核酸酶包含紧凑型TALEN(cTALEN)。这些核酸酶是 将TALEDNA结合域连接于TevI核酸酶结构域的单链融合蛋白。所述融合蛋白可用作通 过TALE区域定位的切口酶，或可产生双链断裂，这取决于其中TALEDNA结合结构域相 对于TevI核酸酶结构域的定位（见，Beurdeley等（2013)NatComm: 1-8D0T: 10. 1038/ ncomms2782)。可将任何TALEN与另外的TALEN(例如，一种或多种具有一个或多个mega-TAL 的TALEN(cTALEN或Fokl-TALEN))或其它DNA裂解酶组合使用。
[0114] 在某些实施方案中，核酸酶包含大范围核酸酶（归巢内切核酸酶）或展示裂解活 性的其部分。天然存在的大范围核酸酶识别15-40个碱基对裂解位点并且常分为4个家族： LAGLIDADG家族、GH-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性归巢内切核酸酶包括 I-Scel、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-Ppol、I-SceIII、 1-〇61、1-了6￥1、1-了6￥11和1-了6￥111。其识别序列已知。同样见美国专利第5,420,032 号；美国专利第 6, 833, 252 号；Belfort等（1997)NucleicAcidsRes. 25:3379 - 3388 ; Dujon等（1989)Gene82:115-118 ;Perler等（1994)NucleicAcidsRes. 22, 1125 - 1127; Jasin(1996)TrendsGenet. 12:224 - 228;Gimble等（1996)J.Mol.Biol. 263:163 - 180; Argast等（1998)J.Mol.Biol. 280:345 - 353 和NewEnglandBiolabs目录。
[0115] 来自主要来自LAGLIDADG家族的天然存在的大范围核酸酶的DNA结合结构域已 经用于促进植物、酵母、果蝇属（Drosophila)、哺乳动物细胞和小鼠中的位点特异性基因 组修饰，但是这种方法已限于保存大范围核酸酶识别序列的同源基因的修饰（Monet等 (1999),Biochem.Biophysics.Res.Common. 255:88-93)或已经向其中引入了识别序列的预 工程化基因组（Route等（1994)，Mol.Cell.Biol. 14:8096-106;Chilton等（2003)Plant Physiology. 133:956-65;Puchta等（1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:5055-60; Rong等（2002)，GenesDev. 16:1568-81;Gouble等（2006)，J.GeneMed.8 (5):616-622)〇 相应地，已经尝试在医学或生物技术相关位点工程化大范围核酸酶以表现出新型结合 特异性（Porteus等（2005)，Nat.Biotechnol. 23:967-73;Sussman等（2004)，J.Mol. Biol.342:31-41;Epinat等（2003)，NucleicAcidsRes.31:2952-62 ;Chevalier等（2002) Molec.Cell10:895-905;Epinat等（2003)NucleicAcidsRes. 31:2952-2962;Ashworth 等（2006)Nature441:656-659;Paques等（2007)CurrentGeneTherapy7:49-66;美国专 利公布第 20070117128、20060206949、20060153826、20060078552 和 20040002092 号）。另 外，来自大范围核酸酶的非天然存在或经工程化的DNA结合结构域也已经与来自异源核酸 酶（例如，FokI)的裂解结构域可操作地连接和/或来自大范围核酸酶的裂解结构域可与 异源DNA结合结构域（例如，ZFP或TALE)可操作地连接。
[0116] 在其它实施方案中，核酸酶为锌指核酸酶（ZFN)或TALEDNA结合结构域-核酸酶 融合物（TALEN)。ZFN和T