ALEN包含已经工程化为与所选基因中的靶位点和裂解结构域或 裂解半结构域结合（例如，来自如本文所述的限制性和/或大范围核酸酶）的DNA结合结 构域（锌指蛋白或TALEDNA结合结构域）。
[0117] 如以上所详细描述，锌指结合结构域和TALEDNA结合结构域可经工程化为与 所选序列结合。见，例如，Beerli等（2002)NatureBiotechnol. 20:135-141;Pabo等 (2001)Ann.Rev.Biochem. 70:313-340;Isalan等（2001)NatureBiotechnol. 19:656-660 ; Segal等（2001)Curr.Opin.Biotechnol. 12:632-637;Choo等（2000)Curr.Opin.Struct. Biol. 10:411-416。与天然存在的蛋白相比，工程化锌指结合结构域或TALE蛋白可具有新 型结合特异性。工程化方法包括但不限于合理的设计和各种类型的选择。合理的设计包括 (例如）使用包含三联体（或四联体）核苷酸序列和单独锌指或TALE氨基酸序列的数据库， 其中每个三联体或四联体核苷酸序列与锌指或TALE重复单位的结合特定三联体或四联体 序列的一个或多个氨基酸序列缔合。见，例如，美国专利6, 453, 242和6, 534, 261，其通过引 用整体并入本文。
[0118] 靶位点的选择；和用于融合蛋白（和编码其的多核苷酸）的设计和构建对于本领 域普通技术人员来说是已知的并且描述于美国专利第7, 888, 121和8, 409, 861号（通过引 用整体并入本文）中。
[0119] 另外，如这些和其它参考文献中所公开那样，锌指结构域、TALE和/或多指锌指 蛋白可使用任何适合的接头序列，包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头（例如， TGEKP(SEQIDN0:3)、TGGQRP(SEQIDN0:4)、TGQKP(SEQIDN0:5)和 /或TGSQKP(SEQID N0:6))连接在一起。对于长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头，见例如美国专利第 6, 479, 626、6, 903, 185和7, 153, 949号。本文所述蛋白质可包括在蛋白质的单独锌指之间 适合接头的任何组合。同样见，美国临时专利申请第61/343, 729号。
[0120] 因此，核酸酶例如ZFN、TALEN和/或大范围核酸酶可包含任何DNA结合结构域 和任何核酸酶（裂解）结构域（裂解结构域、裂解半结构域）。如上所述，裂解结构域可 能与DNA结合结构域异源，例如锌指或TAL效应子DNA结合结构域和来自核酸酶的裂解结 构域，或大范围核酸酶DNA结合结构域和来自不同核酸酶的裂解结构域。异源裂解结构 域可从内切核酸酶或外切核酸酶获得。可从中得到裂解结构域的示例性内切核酸酶包括 但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。见，例如，2002-2003目录，NewEngland Biolabs，Beverly，MA;和Belfort等（1997)NucleicAcidsRes. 25:3379-3388。已知 另外的裂解DNA的酶（例如，SI核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I;微球菌核酸酶；酵 母H0 内切核酸酶；同样见Linn等（编辑）Nucleases,ColdSpringHarborLaboratory Press, 1993)。这些酶中的一种或多种（或其功能片段）可用作裂解结构域和裂解半结构 域的来源。
[0121] 类似地，裂解半结构域可源自正如上面提出的对于裂解活性需要二聚化的任何核 酸酶或其部分。一般而言，如果融合蛋白包含裂解半结构域，则裂解需要两个融合蛋白。可 选地，可使用包含两个裂解半结构域的单一蛋白质。所述两个裂解半结构域可源自相同 内切核酸酶（或其功能片段），或每个裂解半结构域可源自不同内切核酸酶（或其功能片 段）。另外，两个融合蛋白的靶位点优选相对于彼此布置，以致两个融合蛋白与其各自靶位 点的结合使裂解半结构域处于允许（例如）通过二聚化使裂解半结构域形成功能裂解结构 域的相互空间定位。因此，在某些实施方案中，靶位点的近边间隔5-8个核苷酸或15-18个 核苷酸。然而，任何整数数量的核苷酸或核苷酸对可插入两个靶位点之间（例如，2至50个 核苷酸对或更多）。一般而言，裂解位点位于靶位点之间。
[0122] 限制性内切核酸酶（限制酶）存在于许多物种中并且能够与DNA进行序列特异性 结合（在识别位点），并在结合位点或附近裂解DNA。某些限制酶（例如IIS型）在从识 别位点移出的位点处裂解DNA并且具有可分离的结合和裂解结构域。例如，IIS型酶Fok I在从一条链上的识别位点开始9个核苷酸处和从另一条链上的识别位点开始13个核苷 酸处催化DNA的双链裂解。见，例如，美国专利5, 356, 802、5, 436, 150和5, 487, 994 ;以及 Li等（1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279;Li等（1993)卩『〇。.恥七1.八。&(1.5(^· USA90:2764-2768;Kim等（1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887;Kim等（1994b) J.Biol.Chem. 269:31，978-31，982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种 IIS型限制酶的裂解结构域（或裂解半结构域）和可能或可能未经工程化的一种或多种锌 指结合结构域。
[0123] 裂解结构域可与结合结构域分离的示例性IIS型限制酶为FokI。这种特殊的酶 呈二聚体时有活性。Bitinaite等（1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10, 570-10, 575。相 应地，为了本公开的目的，将FokI酶用于公开的融合蛋白中的部分视为裂解半结构域。因 此，为了使用锌指-FokI融合进行靶向双链裂解和/或靶向置换细胞序列，各包含FokI 裂解半结构域的两种融合蛋白可用于重新组成有催化活性的裂解结构域。可选地，也可使 用含有锌指结合结构域和两个FokI裂解半结构域的单一多肽分子。在本公开的其它地方 提供了使用锌指-FokI融合进行靶向裂解和靶向序列改变的参数。
[0124] 裂解结构域或裂解半结构域可为保持裂解活性，或保持多聚化（例如，二聚化）以 形成功能裂解结构域的能力的蛋白质的任何部分。
[0125] 在整体并入本文的国际公布W0 07/014275中描述了示例性IIS型限制酶。另外 的限制酶还含有可分离的结合和裂解结构域，并且这些为本公开所涵盖。见，例如，Roberts 等（2003)NucleicAcidsRes. 31:418-420。
[0126] 在某些实施方案中，例如美国专利第7, 914, 796、8, 034, 598和8, 623, 618号；和美 国专利公布第20110201055号中所述，裂解结构域包含最小化或防止均二聚的一个或多个 工程化裂解半结构域（也称为二聚化结构域突变体），其全部内容通过引用整体并入本文。 FokI的位置 446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537 和 538的氨基酸残基全部为影响FokI裂解半结构域二聚化的靶标。
[0127] 形成专性杂二聚体的FokI的示例性工程化裂解半结构域包括一对，其中第一裂 解半结构域包括在FokI的位置490和538的氨基酸残基处的突变而第二裂解半结构域包 括在氨基酸残基486和499处的突变。
[0128] 因此，在一个实施方案中，490处的突变以Lys(K)置换Glu(E) ;538处的突变以 Lys(K)置换Iso(I) ;486处的突变以Glu(E)置换Gln(Q);并且位置499处的突变以Lys(K) 置换Iso(I)。具体地，通过使一个裂解半结构域中的位置490(E-K)和538(I-K)突变 以生成命名为"E490K:I538K"的工程化裂解半结构域并且通过使另一裂解半结构域中的位 置486(Q-E)和499(I-L)突变以生成命名为"Q486E:I499L"的工程化裂解半结构域制 备本文所述的工程化裂解半结构域。本文所述的工程化裂解半结构域为其中异常裂解减到 最少或消除的专性杂二聚体突变体。见，例如，美国专利公布第2008/0131962号，出于种 种目的，其公开内容通过引用整体并入。在某些实施方案中，工程化裂解半结构域包含位置 486、499和496(相对于野生型FokI编号）处的突变，例如以Glu(E)残基置换位置486处 的野生型Gin(Q)残基，以Leu(L)残基置换位置499处的野生型Iso(I)残基和以Asp(D)或 Glu(E)残基置换位置496处的野生型Asn(N)残基的突变（也分别称为"ELD"和"ELE"结 构域）。在其它实施方案中，工程化裂解半结构域包含位置490、538和537 (相对于野生型 FokI编号）处的突变，例如以Lys(K)残基置换位置490处的野生型Glu(E)残基，以Lys(K) 残基置换位置538处的野生型Iso(I)残基和以Lys(K)残基或Arg(R)残基置换位置537 处的野生型His(H)残基的突变（也分别称为"KKK"和"KKR"结构域）。在其它实施方案 中，工程化裂解半结构域包含位置490和537 (相对于野生型FokI编号）处的突变，例如以 Lys(K)残基置换位置490处的野生型Glu(E)残基和以Lys(K)残基或Arg(R)残基置换位 置537处的野生型His(H)残基的突变（也分别称为"KIK"和"KIR"结构域）。（见美国专 利公布第20110201055号）。
[0129] 可使用任何适合方法，例如如美国专利第7, 914, 796、8, 034, 598和8, 623, 618号； 和美国专利公布第20110201055号中所述，通过定点诱变野生型裂解半结构域（FokI)制 备本文所述的工程化裂解半结构域。
[0130] 可选地，可使用所称的"裂解酶"技术，在体内在核酸靶位点处组装核酸酶（见例 如美国专利公布第20090068164号）。此类裂解酶的组成部分可在任一单独表达构建体上 表达，或者可连接在一开放阅读框中，其中例如通过自我裂解2A肽或IRES序列将单独组成 部分分隔开。组成部分可为单独锌指结合结构域或大范围核酸酶核酸结合结构域的结构 域。
[0131] 使用之前，例如在如W0 2009/042163和20090068164中所述的基于酵母的染色体 体系中，可筛选核酸酶（例如，ZFN和/或TALEN)的活性。使用本领域已知的方法可容易地 设计核酸酶表达构建体。见，例如，美国专利公布20030232410、20050208489、20050026157、 20050064474、20060188987、20060063231 ;和国际公布W0 07/014275。核酸酶的表达受组 成型启动子或诱导型启动子，例如在棉子糖和/或半乳糖的存在下激活（去阻遏）而在葡 萄糖的存在下阻遏的半乳糖激酶启动子的控制。
[0132] 在某些实施方案中，核酸酶包含CRISPR/Cas体系。CRISPR(成簇的规律性间隔的 短回文重复序列）基因座（其编码所述体生活经验的RNA组分）和cas(CRISPR-结合的）基 因座（其编码蛋白质（Jansen等，2002.Mol.Microbiol. 43:1565-1575 ;]\&11?^(^1等，2002· NucleicAcidsRes. 30:482-496 ;Makarova等，2006.Biol.Direct1:7;Haft等，2005.PLoS Comput.Biol.I:e60))组成CRISPR/Cas核酸酶体系的基因序列。微生物宿主中的CRISPR 基因座含有CRISPR-结合的（Cas)基因以及能够对CRISPR介导的核酸裂解的特异性编程 的非编码RNA元件的组合。
[0133] II型CRISPR是最充分表征的体系之一并且在4个连续步骤中进行靶向DNA双 链断裂。首先，从CRISPR基因座转录两个非编码RNA、前-crRNA阵列和tracrRNA。第二， tracrRNA与前-crRNA的重复区域杂交，并且介导前-crRNA至含有单个间隔子序列的成熟 crRNA的加工。第三，所述成熟的crRNA:tracrRNA复合物通过crRNA上的间隔子与紧接原 型间隔序列邻近基序（PAM)的靶DNA上的原型间隔序列之间的沃尔森-克里克碱基配（靶 识别的额外要求）对将Cas9导向革E1DNA。最后，Cas9介导革E1DNA的裂解以在原型间隔序列 内产生双链断裂。CRISPR/Cas体系的活性由3个步骤组成：（i)外来DNA序列至CRISPR阵 列的插入，以在称为'适应'的过程中预防将来的攻击，（ii)相关蛋白质的表达，以及阵列的 表达和加工，随后（iii)RNA介导的干扰异形核酸。因此，在细菌细胞中，几种所谓的'Cas' 蛋白牵涉CRISPR/Cas体系的天然功能并且在功能诸如外来DNA的插入等中起作用。
[0134] 在某些实施方案中，Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白的〃功能性衍生物〃。天 然序列多肽的"功能性衍生物"是具有与天然序列多肽共同的定性生物学性质的化合物。 "功能性衍生物"包括，但不限于，天然序列的片段和天然序列多肽的衍生物及其片段，只 要它们具有与相应天然序列多肽共同的生物活性。本文中涉及的生物活性是功能性衍生物 将DNA底物水解成片段的能力。术语"衍生物"包括多肽的氨基酸序列变体、共价修饰和 其融合物。Cas多肽的合适的衍生物或其片段包括，但不限于Cas蛋白或其片段的突变体、 融合物、共价修饰。包括Cas蛋白或其片段的Cas蛋白以及Cas蛋白的衍生物或其片段可 从细胞获得或化学合成，或通过这两种方法的组合获得。所述细胞可以是天然产生Cas蛋 白的细胞，或天然产生Cas蛋白和经遗传工程化以更高表达水平产生内源Cas蛋白或从外 源引入的核酸产生Cas蛋白的细胞，所述核酸编码与内源Cas相同或不同的Cas。在一些情 况下，所述细胞不天然产生Cas蛋白并且经遗传工程化产生Cas蛋白。
[0135] 在例如美国临时申请第61/823,689号中公开了靶向HLA和其它基因的示例性 CRISPR/Cas核酸酶体系。
[0136] 递送
[0137] 可通过任何适合方式，包括（例如）通过注射蛋白和/或mRNA，向靶细胞递送蛋白 质（例如，核酸酶和非经典HLA分子）、编码蛋白质的多核苷酸和包含本文所述的蛋白质和 /或多核苷酸的组合物。
[0138] 适合的细胞包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。此类细胞或由此 类细胞产生的细胞系的非限制性实例包括T细胞、C0S、CH0 (例如，CH0-S、CH0-K1、 CH0-DG44、CH0-DUXB11、CH0-DUKX、CH0K1SV)、VER0、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、 HaK、NS0、SP2/0-Agl4、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6 细 胞以及昆虫细胞例如草地贪夜蛾（Spodopterafugiperda)(Sf)或真菌细胞例如酵母属 (Saccharomyces)，毕赤酵母（Pichia)和裂殖酵母（Schizosaccharomyces)。在某些实施方 案中，细胞系为CHO-KUMDCK或HEK293细胞系。适合的细胞还包括干细胞，举例而言，例如 胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPS细胞）、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。
[0139] 例如，在美国专利第 6, 453, 242、6, 503, 717、6, 534, 261、6, 599, 692、6, 607, 882、 6, 689, 558、6, 824, 978、6, 933, 113、6, 979, 539、7, 013, 219 和 7, 163, 824 号中描述了递送包 含如本文所述的DNA结合结构域的蛋白质的方法，所述专利全部的公开内容通过引用整体 并入本文。
[0140] 还可使用含有编码一种或多种DNA结合蛋白的序列的载体来递送如本文所述的 DNA结合结构域和包含这些DNA结合结构域的融合蛋白。另外，还可通过这些载体递送另 外的核酸（例如，供体和/或编码非经典HLA蛋白的序列）。可使用任何载体体系，包括但 不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体和 腺相关病毒载体等。同样，见，美国专利第6, 534, 261、6, 607, 882、6, 824, 978、6, 933, 113、 6, 979, 539、7, 013, 219和7, 163, 824号，其通过引用整体并入本文。此外，明显的是，任何这 些载体可包含一个或多个编码DNA结合蛋白的序列和/或适当时另外的核酸。因此，当向 细胞引入一种或多种如本文所述的DNA结合蛋白和适当时另外的DNA时，可在相同载体或 不同载体上携带它们。当使用多个载体时，每个载体均可包含编码一个或多个DNA结合蛋 白的序列和必需时另外的核酸。
[0141] 基于病毒和非病毒的常规基因转移方法可用于在细胞（例如，哺乳动物细胞）和 靶组织中引入编码工程化DNA结合蛋白的核酸以及必要时共引入另外的核苷酸序列。此类 方法也可用于在体外向细胞施用核酸（例如，编码DNA结合蛋白、供体和/或非经典HLA蛋 白）。在某些实施方案中，施用核酸用于体内或体外基因治疗用途。非病毒载体递送系统包 括DNA质粒、裸露核酸和与递送媒介物例如脂质体或泊洛沙姆（poloxamer)复合的核酸。病 毒载体递送系统包括在递送到细胞后具有附加体或整合基因组的DNA和RNA病毒。对于基 因治疗过程的综述，见Anderson,Science256:808-813 (1992);Nabel和Feigner，TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani和Caskey，TIBTECH11:162-166(1993) ;Dillon，TIBTECH 11:167-175(1993) ；Miller,Nature357:455-460(1992)；VanBrunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988) ；Vigne,RestorativeNeurologyandNeuroscience 8:35-36(1995) ;Kremer和Perricaudet，B;ritishMedicalBulletin51(1):31-44(1995); Haddada等，在CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology中，Doerfler和B0hm (编辑）（1995);和Yu等，GeneTherapy1:13-26(1994)。
[0142] 核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪法、病毒颗粒、月旨 质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA、mRNA、人工病毒粒子和试剂增强 的DNA摄取。使用（例如）Sonitron2000系统（Rich-Mar)的声致穿孔法也可用于核酸的 递送。在一个优选实施方案中，将一种或多种核酸作为mRNA递送。还优选使用加帽的mRNA 以增加翻译效率和/或mRNA稳定性。尤其优选ARCA(抗-反向帽类似物）帽或其变体。见 美国专利第7, 074, 596和8, 153,773号，其通过引用并入本文。
[0143] 另外的示例性核酸递送系统包括AmaxaBiosystems(Cologne,Germany)、 Maxcyte,Inc. (Rockville,Maryland)nBTXMolecularDeliverySystems(Holliston,MA) 和CopernicusTherapeuticsInc.提供的核酸递送系统（见例如US6008336)。例如US5, 049, 386、US4, 946, 787和US4, 897, 355中描述了脂质转染并且脂质转染试剂在市场上 有售（例如，Transfectam?、Lipofectin?和Lipofectamine?RNAiMAX)。适合多核苷酸的 有效受体-识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括Feigner(W0 91/17424、W0 91/16024) 的脂质。可向细胞（活体外施用）或祀组织（体内施用）递送。
[0144] 脂质：核酸复合物，包括靶向脂质体例如免疫脂质复合物的制备为本领域的技 术人员众所周知（见，例如，Crystal,Science270:404-410(1995);Blaese等，Cancer GeneTher. 2:291-297(1995);Behr等，BioconjugateChem. 5:382-389(1994);Remy等， BioconjugateChem. 5:647-654(1994);Gao等，GeneTherapy2:710-722(1995);Ahmad 等，CancerRes. 52:4817-4820(1992);美国专利第 4, 186, 183、4, 217, 344、4, 235, 871、 4, 261，975、4, 485, 054、4, 501，728、4, 774, 085、4, 837, 028 和 4, 946, 787 号）。
[0145] 另外的递送方法包括利用将待递送核酸包装到EnGeneIC递送媒介物（EDV)中。使 用双特异性抗体将这些EDV特异性地递送到靶组织，其中所述抗体的一臂对靶组织具有特 异性而另一臂对EDV具有特异性。抗体将EDV带到靶细胞表面，然后通过胞吞作用将EDV 带入细胞。一旦进入细胞，就释放内含物（见MacDiarmid等（2009)NatureBiotechnology 第27卷（7)第643页）。
[0146] 使用基于RNA或DNA病毒的系统递送编码工程化DNA结合蛋白、非经典HLA分子和 /或所需的其它供体的核酸利用使病毒靶向体内的特定细胞并且将病毒有效载荷运输到核 的高度进化过程。病毒载体可直接向患者（体内）施用或其可用于在体外处理细胞并且向 患者（在活体外）施用经修饰的细胞。递送核酸的基于病毒的常规系统包括但不限于用于 基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关、牛痘和单纯性疱疹病毒载体。用逆转录病 毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法可能整合