31. 1±10. 0% (图 1D)〇
[0148][实施例5]
[0149] [利用Dorsomorphin的替代物的研究]
[0150] 在SIX2阳性细胞的诱导方法1的阶段3中，将Dorsomorphin变更为100ng/ml Noggin(Peprotech)、0.5yMLDN193189(AxonMedChem、1509)或 0·5μΜDMHl(Tocris、 4126)，同样地进行诱导分化，SIX2-tdTomato阳性细胞率结果分别为7·5%、20·4%或 15.4% (分别为图2B、C及D)。
[0151][利用TGF0 1的替代物的研究]
[0152] 在SIX2阳性细胞的诱导方法1的阶段3中，将TGFf3 1变更为50μΜ IDEl(Tocris) 或50μΜIDE2(Tocris)，同样地进行分化诱导，SIX2-tdTomato阳性细胞率结果分别为 8·4%、39·4% (图2E及F)。
[0153] [利用组合的研究]
[0154] 在SIX2阳性细胞的诱导方法1的阶段3中，将Dorsomorphin变更为0· 5μΜ LDN193189,将TGFβ1 变更为 10ng/mlTGFβ2 (Ρ印rotech)或 10ng/mlTGFβ3 (R&D)，同样 地进行诱导分化，SIX2阳性细胞率结果分别为8. 6%、9. 3% (图2G及H)。
[0155][实施例6]
[0156] [0SRl-GFP&SIX2_tdTomato敲入人iPS细胞系的建立]
[0157] 使用与实施例1中记载的同样的方法，由MaeS，etal，NatCommun. 4 :1367, 2013 中记载的0SR1-GFP报告基因人iPS细胞系（3D45)制备0SRl-GFP&SIX2-tdTomato报告基 因iPS人细胞系（4A6C3-10)。
[0158][实施例7]
[0159] [SIX2阳性细胞的诱导方法4]
[0160]〈阶段1>
[0161] 在添加了含有500U/ml青霉素/链霉素（Invitrogen)及5ng/ml重组人碱性成纤 维细胞生长因子（bFGF、Wako)的灵长类ES培养基（R印roCELL)的10cm培养皿上将来自胎 生12. 5天ICR小鼠胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)或SNL饲养细胞（McMahon，A.P.and Bradley，A. (1990)Cell62 ; 1073-1085)(用 15. 5μg/ml的丝裂霉素（协和发酵麒麟）处 理2~3小时，在2X105个细胞/6cm培养皿中接种）用作饲养细胞，将实施例6的方法中 得到的 〇SRl-GFP&SIX2-tdTomato报告基因人iPS细胞系 4A6C3-10 在 37°C、2 ~5% (：02氛 围下培养至成为70%~80%汇合。用PBS冲洗含有细胞的10cm培养皿，用CTK溶液（PBS 中，0· 25%膜蛋白酶（Invitrogen)、0· 1 %胶原酶IV(Invitrogen)、20%KnockOutSR(KSR、 Invitrogen)及ImMCaCl2)在37°C下处理4分钟。通过用PBS冲洗除去CTK溶液之后，替 换为含有 〇.ImMMEMNEAA(Invitrogen)、1000U/ml青霉素 / 链霉素、0. 55mM2-巯基乙醇 (Invitrogen)及 20%KSR的DMEM/F12+Glutamax(Invitrogen)。接着，用细胞刮棒刮取细 胞，接种于进行了 〇. 2%明胶涂覆的6cm培养板上，除去饲养细胞。1小时后，用含有500U/ ml青霉素/链霉素及2 %FBS(HyClone)的DMEM/F12+Glutamax[阶段1培养基]洗涤细胞， 移至包含含有l〇〇ng/ml重组人/小鼠/大鼠激活素A(R&Dsystems)及1μMCHIR99021 的阶段1培养基的超低吸附培养皿（Corning3471)，在37°C、5%C02氛围下培养2天。
[0162] < 阶段2>
[0163] 为了使细胞分化为间介中胚层，将阶段1中得到的细胞团块（拟胚体（EB))移至 利用3}〇11:11611^11(&31'11；[1^)进行了涂覆的24孔板，交换成含有0.11111]\0^[呢44、5001]/ ml青霉素 / 链霉素、0. 55mM2-巯基乙醇、10%KSR、100ng/mlBMP7(重组人BMP7、R&D systems)及 1μΜCHIR99021 的DMEM/F12+Glutamax，在 37°C、5%C02氛围下培养 3 天。
[0164] < 阶段3>
[0165] 阶段2之后，将培养基交换成含有0.1 mMMEMNEAA、500U/ml青霉素/链霉素、 0.55mM2-巯基乙醇、10%KSR、lyMTTNPB(SigmaT3757)及 5ng/mlTGF0 1(P印rotech) 的DMEM/F12+Glutamax，在37°C、5%C02氛围下培养5天。在培养开始后第2天（阶段1开 始（第1天）~第8天）交换成相同条件的培养基。
[0166] < 阶段 4>
[0167] 阶段3之后，将培养基交换成含有0.1 mMMEMNEAA、500U/ml青霉素/链霉 素、0· 55mM2-巯基乙醇、10 %KSR、5ng/mlTGF0 1 及 0· 5μΜDMH1 (Tocris)的DMEM/ F12+Glutamax，在37°C、5%C02氛围下培养17天（从阶段1开始（第1天）到全28天的 培养。图3A)。此时，每3天1次交换成相同条件的培养基。在得到的细胞中使用流式细胞 仪评价0SR1阳性SIX2阳性（0SR1+SIX2+)细胞率，在培养第28天结果为32. 8 % (图3B)。 另外确认：0SR1+SIX2+细胞率在培养第25天达到最大，其后维持至培养28天（图3D)。
[0168][实施例8]
[0169][利用各种TGFβ信号激活剂及BMP抑制剂的组合的研究]
[0170] 对各种TGFβ信号激活剂及ΒΜΡ抑制剂的组合，研究了由所述iPS细胞系 4A6C3-10向0SR1+SIX2+细胞的诱导。具体而言，在以下说明的条件1)~10)之下，研究了 由4A6C3-10向0SR1+SIX2+细胞的诱导。
[0171] 在条件1)~10)的阶段1~2中，分别使用与实施例7的阶段1~2相同的方 法。在条件1)~7)及10)的阶段3中，使用与实施例7的阶段3相同的方法。在条件 8)的阶段3中，在将实施例7的阶段3中的5ng/mlTGFi3 1及1μΜTTNPB替换为5ng/ml TGFi3 2(P印rotech)的培养基中进行培养。在条件9)的阶段3中，在将实施例7的阶段3 中的5ng/mlTGF0 1及ΙμΜTTNPB取代为5ng/mlTGF0 3(P印rotech)的培养基中进行 培养。在各条件的阶段4中，用与实施例7的阶段4相同的方法，或在将实施例7的阶段 4中的5ng/mlTGFi3 1及0. 5μΜDMH1替换为以下的任一种的培养基中进行培养：条件1) 仅〇15〇、条件2)5即/1111了6卩0 1、条件3)〇.5 4]\1〇1!11、条件4)5即/1111了6卩0 1及1〇〇即/1111 Noggin(Peprotech)、条件 5) 5ng/mlTGFβ1 及 0· 5μMDorsomorphin(Merck)、条件 6) 5ng/ mlTGF0 1 及 0·5μΜLDN193189(AxonMedChem)、条件 7)5ng/mlTGF0 1(P印rotech)及 0·5μΜDMH1 (与实施例 7 相同）、条件 8)5ng/mlTGF0 2(P印rotech)及 0·5μΜDMH1、条 件9)5ng/mlTGFβ3(P印rotech)及0·5μMDMHl、条件10)50μMIDE2(Tocris)及0·5μM DMHl〇
[0172]其结果（图4)，在向0SR1+SIX2+细胞的诱导中确认了 ：作为TGFi3信号激活剂， 使用TGFi3 1是有效的，作为BMP抑制剂，使用DMH1是有效的。在实施例7中的阶段4 中，在含有5ng/mlTGF0 1及0. 5μΜDMH1的同时，还含有作为TGF0受体1抑制剂的 SB431542(Tocris) (10μΜ)的培养基中进行培养的情况（条件11))下，向0SR1+SIX2+细胞 的分化被抑制。
[0173][实施例9]
[0174][利用各种人iPS细胞及人ES细胞的研究]
[0175] 用与实施例7所述的方法相同的方法对15种人iPS细胞（由外周血衍生的iPS 细胞585A1、585B1、604A1、604B1、648A1、648B1、692D2 ;由脐带血衍生的iPS细胞606A1、 606BU610B1 ;由成人皮肤成纤维细胞（aHDF)衍生的iPS细胞201B6、201B7、253G1、253G4; 及4A6C3-10)及3种人ES细胞（khESl、khES3、H9) (Proc Natl Acad Sci USA 109， 12538-12543 (2012)、Stem Cells 31,458-466(2013)、）进行处理，利用定量的RT-PCR(Nat Commun 4,1367,（2013))分析0SR1及SIX2的基因表达。通过实施例7所述的方法，在 4A6C3-10以外的多个细胞系中确认了0SR1及SIX2的表达（图5)，确认了本方法也可适用 于其他iPS细胞及ES细胞。
[0176][实施例 10]
[0177][表达标记物分析]
[0178] 用RT-PCR或定量RT-PCR分析在实施例7的诱导工序中进行了处理的4A6C3-10 中的各种表达标记物。将结果示于图3C及E。在阶段1后的细胞中确认了作为后侧新生中 胚层（posteriornascentmesoderm)的标记物的BRACHYURY及TBX6的表达，在阶段2后 的细胞中确认了作为间介中胚层的标记物的0SR1的表达（图3C)。其后，作为后肾间充质 (间层）（後腎間充織（間間））标记物的WT1、PAX2、SIX2及后侧（posterior)Η0Χ基因的 表达被激活（图3C)。在培养第28天的0SR1+SIX2+细胞中，表达了作为肾前体细胞标记物 的CITED1、EYA1、PAX2、WT1、SALL1、ITGA8、CDH11、⑶NF、Η0ΧΑ11 及H0XD11，另一方面，在该 细胞中没有检出作为间质标记物的F0XD1、作为中肾管标记物、输尿管芽的H0XB7(图3E)。
[0179][肾前体细胞的评价]
[0180] 用流式细胞仪分离在实施例7的诱导工序中进行了处理的培养第28天的 0SR1+SIX2+细胞，在涂覆了SynthemaxII的96孔板上以3. 0父104个细胞/孔接种，在添加 有10μΜY-27632的REGM培养基（L0NZA)中、在37°C、5%C02氛围下培养7天。将得到的 细胞通过针对NEPHRIN(肾小球足细胞标记物）、AQP1及MEGALIN(肾小管近曲小管标记物） 以及UR0MUC0ID(亨利氏环标记物）的免疫染色，确认了各标记物的阳性细胞（图6A)。
[0181]接着，在含有添加有 50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及 10μΜY-27632(Wako)的UBC 培养上清液（参照以下）的纺锤底低吸附96孔板（LipidureCoat、N0F)上以1.0X105个 细胞/孔接种相同的〇SRl+SIX2+细胞，在37°C、5%C02氛围下培养24小时。接着，将培养 基替换为添加有50ng/mlΒΜΡ7、0· 5μΜBlO(Wako)及10μΜY-27632的UBC培养上清液， 培养2~3天后，回收细胞，在进行了丝裂霉素处理的表达Wnt4的NIH3T3(0safuneK，et al. (2006)，Development133 :151-61)上以 3.0X104个细胞/孔（24孔板）接种，培养5 ~ 7天。将得到的细胞通过针对翅荚百脉根凝集素（LotusTetragonolobuslectin;LTL)(肾 小管近曲小管标记物）、LAMININ(极性上皮细胞标记物）、⑶HI(肾小管远曲小管标记物） 以及P0D0CALYXIN及WT1 (肾小球足细胞标记物）的免疫染色，确认了各标记物的阳性细胞 (图 6B)。
[0182] 进而，将0SR1+SIX2+细胞与E11.5的小鼠胚胎脊髓进行器官培养。详细而言， 在含有添加有 50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及 10μΜY-27632(Wako)的UBC培养上清液 (参照以下）的纺锤底低吸附96孔板（LipidureCoat、N0F)上以1.ΟΧΙΟ5个细胞/孔 接种0SR1+SIX2+细胞，在37°C、5%C02氛围下培养24小时。接着，将培养基替换为添加有 50ng/mlΒΜΡ7、0· 5μΜBlO(Wako)及 10μΜY-27632 的UBC培养上清液，培养 2 ~3 天后， 回收细胞，与Ε11. 5的小鼠胚胎脊髓同时在具有0. 4μπι孔的聚碳酸酯（polycarbonate) 过滤器（Millipore)上的空气-培养液的界面、在37°C下进行培养。在培养液侧使用 添加有 500U/ml青霉素 / 链霉素及 10 %FBS的DMEM(Nacalaitesque)(OsafuneK，et al. (2006)，Developmentl33 :151-61)。一周后，将得到的细胞通过针对LTL、LAMININ、 ⑶HUP0D0CALYXIN及WT1的免疫染色，确认了各标记物的阳性细胞（图6C)。
[0183] 同样地，将0SR1+SIX2+细胞与E11. 5的小鼠胚胎后肾进行器官培养。详细而言，将 0SR1+SIX2+细胞在含有添加有 50ng/mlBMP7(R&Dsystems)及 10μΜY-27632(Wako)的UBC 培养上清液（参照以下）的纺锤底低吸附96孔板（LipidureCoat、N0F)上以1.OX105个 细胞/孔接种，在37°C、5%C02氛围下培养24小时。接着，将培养基替换为添加有50ng/ mlΒΜΡ7、0· 5μΜBlO(Wako)及10μΜY-27632的UBC培养上清液，培养2~3天后，回收 细胞，使用Accumax进行分离。从ICR小鼠中提取E11. 5的小鼠胚胎后肾，在DMEM中切碎， 在0. 05%胰蛋白酶-EDTA中放置10分钟，利用吸管吹打进行分离。分离的小鼠胚胎后肾 细胞在添加有500U/ml青霉素/链霉素及10%FBS的DMEM中、在37°C下静置10分钟之 后，用40μπι细胞过滤器（BD)进行过滤。将得到的5.0X105个细胞的小鼠胚胎后肾细胞与 5.ΟΧ105个细胞的所述用Accumax进行了分离的0SR1+SIX2+细胞进行混合，在纺锤底低吸 附96孔板上、在添加有10μΜY-27632、500U/ml青霉素/链霉素及10%FBS的DMEM中培 养一昼夜，以形成聚集体。将得到的聚集体在具有0.4μπι孔的聚碳酸酯（polycarbonate) 过滤器（Mi11ipore)上的空气-培养液的界面、在37 °C下进行培养。在培养液侧使用添加有 500U/ml青霉素 / 链霉素及 10%FBS的DMEM(Nacalaitesque)(Uchino，S.etal.JAMA294，