用于生物合成生产的重组宿主细胞的制作方法
【专利说明】用于生物合成生产的重组宿主细胞 发明领域
[0001] 本发明涉及一种细胞，该细胞包括编码一种多酶复合体的异源多核苷酸，该多酶 复合体参与苯丙烷代谢途径，并且涉及其在香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成中用 途。
【背景技术】
[0002] 香草醛是在食品、饮料、香料和药物中的最重要的芳香风味化合物之一。从兰科扁 叶香果兰（Vanillaplanifolia)豆中提取的天然香草醛是相当昂贵的。香草豆的生产是 一个漫长的过程，其高度依赖于适合的土壤和气候条件。在4-5年的栽培后豆子出现并且 该芳香在需要6个月的所谓的"固化"的长时间过程后在水果中发育出。消费者对天然香 草醛的需求高度超过对通过植物源提取的香草醛的量。少于5%的全世界香草醛生产来自 天然香草。由于天然香草提取物的稀缺和费用，长期以来已经存在合成制备其主要成分的 关注。香草醛（4-羟基-3-甲氧基苯甲-醛）是香草风味的主要感官成分。
[0003] 因为对香草醛的需求高于可从兰科扁叶香果兰豆中提取的，所以其余部分通过可 替代的方式产生。化学合成是香草醛的最重要来源。香草醛首先是从发现于丁子香的油中 的丁香酚合成的并且后来从包含亚硫酸盐液体的木质素中合成的，该木质素是一种在纸张 生产中木浆加工的副产物。尽管一些香草醛仍然由木质素废弃物制备，现今大部分合成的 香草醛以一个两步法从石油化学的前体：愈创木酚和乙醛酸合成。香草醛也可通过姜黄素、 丁香酚或胡椒碱的分子断裂化学地产生。
[0004] 天然和合成的香草醛的价格之间的大差异、增加的消费者导向的对"天然的"和 "健康的"香料需求、以及对"天然的"市场要求的服务已经导致对香料工业日益增长的关注 以从其他天然来源通过生物转化 1'2'3'4'5产生天然香草醛。微生物细胞和其他的酶在精细化 学品的合成中作为生物催化剂的使用已经在绿色化学和白色生物技术中备受关注。由于欧 洲社会法律，此类生物转化的产物被认为是天然的（包含在术语"天然产物"下通过活细胞 或它们的酶从生物源产生的产物。
[0005] 用于生产的可替代的基于生物技术的方法是基于木质素、二苯乙烯型酚、异丁子 香酚、丁香酚、阿魏酸或芳香族氨基酸的生物转化，并且基于从头生物合成、应用真菌、细 菌、植物细胞或基因工程微生物。虽然经由异丁子香酚的转化的香草醛生产已经在各种 微生物中广泛被报道，包括黑曲霉 6;克雷白氏菌属、肠杆菌属和沙雷氏菌属的菌株7;玫 瑰色红球菌8;枯草芽孢杆菌B2 梭形芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌HS8n;硝基还原假单胞 菌12;恶臭假单胞菌13;绿针假单胞菌 14;短小芽孢杆菌15;以及伊文思诺卡氏菌（Nocardia iowensis)16。最近描述了使用代谢工程化酵母菌株从葡萄糖从头合成17。
[0006] 酿酒酵母是一种有用的细胞，工厂依赖其生产高价值工业生物技术产品。它非常 适合于生物精炼工艺，归因于其细胞-再利用发酵和其对抗各种压力（诸如低pH、高温和各 种抑制剂1S)的非凡耐受性的能力。此外，酿酒酵母是一种被极好地表征的促进代谢工程19 的模式生物，2°归因于全基因组序列的可得性和代谢途径的详细表征21。
[0007]US6372461B1描述了香草醛通过需要五种由重组微生物提供的酶的微生物-催 化转化步骤从碳源的合成以及酶-催化的还原步骤以通过芳基-醛脱氢酶还原香草酸。
[0008]EP2388333A2描述了一种能够生产香草醛的微生物细胞，包括至少三种异源酶 活性，即3-脱氢莽草酸脱水酶、芳香族羧酸还原酶和30-甲基转移酶活性。
[0009]W0 2011124693A1描述了通过部分同源的体内重组产生基因嵌合体的方法，由此 可以构建在自然界中不存在的代谢途径。
[0010] US2003/070188A1描述了香草醛的生物合成途径，该生物合成途径包括P-香豆 酸向P-羟基苯甲醛的转化以及在具有改善的香草醛生产的经培养的扁叶香果兰（Vanilla planifolia)或转基因细胞和植物中的香草醛生产。
[0011] 汉森（Hansen)等人（《应用与环境微生物学》(ApplEnvironMicrobiol.) 2009 ; 75(9):2765-2774)描述了香草酸在裂殖酵母（粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe))和面包酵母（(Saccharmomycescerevisiae))中的从头生物合成。这些工程化途 径用去氢莽草酸作为底物起始。
[0012] 迪吉奥亚（DiGioia)等人（《生物技术杂志》（J.Biotechnol. ) 2011 ; 156:309-316)描述了焚光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens)用于从阿魏酸生产香草 醛的代谢工程。
[0013]布罗查多（Brochado)等人（微生物细胞工厂（MicrobialCellFactories) 2010; 9:84)描述了通过计算机模拟设计改善的香草醛在面包酵母中的生产。
[0014] 普里费尔（Priefert)等人（《应用微生物生物技术》（Appl.Microbiol. Biotechnol. )2001 ;56:296_314)描述了香草醛的生物技术生产和基于木质素、二苯乙稀 型酚、异丁子香酚、丁香酚、阿魏酸或芳香族氨基酸的生物转化的不同生物合成途径。
[0015] 考尔（Kaur)等人（《应用生物化学与微生物》(Appl.Biochem.Microbiol.) 2013; 169:1353-1372)提供了用于香草醛生产的生物技术和分子方法的综述。
[0016] 发明概沐
[0017] 本发明的目的是引入一种酶或途径至宿主细胞中通过在宿主细胞中的生物合成 提供一种增强的或新的香草醛形成能力。
[0018] 该目的通过本发明的主体来解决。
[0019] 根据本发明，提供了一种细胞，该细胞包括编码一种多酶复合体的异源多核苷酸， 该多酶复合体参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成，该多酶复合 体包括用于香豆酸和巴豆酸酶的生物合成的酶。在此，香豆酸被具体地理解为P-香豆酸。
[0020] 具体而言，本发明提供一种细胞，该细胞包括编码一种多酶复合体的异源多核苷 酸，该多酶复合体参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成，该多酶 复合体包括用于香豆酸的生物合成的以下各项酶，这些酶包括苯丙氨酸氨解酶（PAL)、酪氨 酸氨解酶（TAL)或苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶（PAL/TAL)中的任一种，以及任选地一种或多 种另外的酶以将芳香族氨基酸转化为香豆酸，其中该多酶复合体进一步包括将香豆酸转化 为香草醛或其羟基苯甲醛前体的酶，包括巴豆酸酶。
[0021] 该香草素或羟醛前体可以在商业上如此使用，例如作为终端产物，或作为中间体 例如以使用该中间体作为前体进一步产生衍生物或终端产物。
[0022] 根据一个具体方面，该多酶复合体包括至少所有如用于使用香豆酸作为前体的香 草醛生物合成所必要的酶，或如香草醛的生物合成或来自碳源的香草醛生物合成途径的中 间体或代谢物的所有酶，例如转化为香草醛所必要的那些酶，例如在此所述的那些酶。
[0023] 根据另外的具体方面，该多酶复合体包括至少所有使用芳香族氨基酸作为前体用 于香豆酸的生物合成的酶，至少用于转化为香豆酸所必要的那些，例如在此所述的那些。
[0024] 具体地，该多酶复合体包括苯丙氨酸氨解酶（PAL)、肉桂酸羟化酶（C4H)、细胞色 素P450还原酶（CPR)、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶。
[0025] 根据一个另外的具体方面，该多酶复合体包括酪氨酸氨解酶（TAL)、辅酶A连接 酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶。
[0026] 根据另一个具体方面，该多酶复合体包括苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶（PAL/TAL)、肉 桂酸羟化酶（C4H)、细胞色素P450还原酶（CPR)、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲 基转移酶。
[0027] 根据一个具体实施例，该多酶复合体包括辅酶A连接酶，优选4-香豆酸-辅酶A 连接酶（4CL)。
[0028] 根据另一个具体实施例，该多酶复合体包括3-单加氧酶，优选酚羟化酶（PheA)和 黄素还原酶（FLARED)或羟基苯甲酸羟化酶（ΗΒΗ)。
[0029] 根据另一个具体实施例，该多酶复合体包括甲基转移酶，优选0-甲基转移酶，优 选3-0-甲基转移酶或4-0-甲基转移酶，优选咖啡酸0-甲基转移酶（C0MT)。
[0030] 根据另一个具体实施例，该巴豆酸酶是烯酰-辅酶Α水合酶（ECH)。
[0031] 根据一个具体方面，该巴豆酸酶是一种负责p-香豆酰辅酶A和/或阿魏酰辅酶A 的链还原反应的ECH。
[0032] 根据一个具体方面，该巴豆酸酶是一种将p-香豆酰辅酶A转化为4-羟基苯甲醛 的ECH。
[0033] 根据一个另外的具体方面，该巴豆酸酶是一种将阿魏酰辅酶A转化为香草醛的 ECH〇
[0034] 根据一个具体方面，该细胞进一步包括
[0035] a) -种编码羧基还原酶（CAR)的异源多核苷酸，任选地连同一种编码磷酸泛酰巯 基乙胺基转移酶（PPTase)的多核苷酸；和/或
[0036] b) -种编码醇氧化酶、优选地香草醇氧化酶的异源多核苷酸（VA0)。
[0037] 根据一个具体实施例，这些多核苷酸编码一系列由单个多顺反子操纵子表达的 酶，或编码一系列的由分离的启动子表达的酶。
[0038] 优选地，这些多核苷酸被稳定地整合至细胞基因组中。
[0039] 该细胞可以是一种真核细胞或原核细胞，优选地选自下组，该组由以下各项组成： 酵母、哺乳动物、昆虫、植物和细菌的细胞。
[0040] 具体而言，该细胞是一种DNA修复缺陷型细胞，包括在错配修复（MMR)中的任何细 胞缺陷或在DNA修复中的任何其他缺陷；或是一种生产细胞，包括在DNA修复缺陷型细胞中 拼接的多核苷酸簇。
[0041] 具体地，这些多核苷酸源自至少两种不同的物种。
[0042] 根据一个具体方面，这些酶中的至少一个是一种嵌合酶。
[0043] 根据本发明，具体地提供了这样一种细胞，该细胞包括一种包含编码参与苯丙烷 代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成的至少五种酶、优选地至少六种酶、优 选地至少七种酶的异源多核苷酸的多酶复合体，其中这些酶中的至少一个是一种嵌合酶。
[0044] 在一个优选实施例中，该嵌合酶优选地是
[0045]a)由不同多核苷酸片段构成的核苷酸序列编码的，这些片段被拼接成一种嵌合核 苷酸序列；和/或
[0046] b)由亲本多核苷酸中的一种或多种核苷酸的插入、缺失和/或替代而获得核苷酸 序列编码的。
[0047] 具体地，编码该嵌合酶的多核苷酸是由不同多核苷酸的片段构成的，优选地具有 至少30%的序列一致性，其片段被拼接成一种嵌合的核苷酸序列。此外，这些片段可以任选 地被诱变以包括衍生自一种或多种多核苷酸的突变序列，例如通过插入、缺失和/或替代 一种或多种核苷酸来突变。
[0048] 可替代地，编码该嵌合酶的多核苷酸是衍生自仅一个亲本多核苷酸及一个例如通 过诱变、或通过插入、缺失和/或替代一种或多种核苷酸而获得的基因嵌合体。
[0049] 根据本发明，进一步提供了一种通过将编码参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟 基苯甲醛前体的生物合成的多酶复合体的异源多核苷酸引入至该细胞基因组中来工程化 本发明的细胞的方法，该方法包括
[0050]a)提供编码个体酶的多核苷酸，任选地，其中这些多核苷酸中的至少一个是由不 同多核苷酸的片段构成的，其片段被拼接为一种嵌合的核苷酸序列；
[0051] b)将这些多核苷酸拼接至簇中并且优选地通过体内重组将所述簇整合至该细胞 基因组中；并且
[0052] c)任选地工程化一种生产细胞，其中将所述簇稳定地整合至该生产细胞基因组 中。
[0053] 具体地，至少两种不同的编码个体酶的多核苷酸以全长多核苷酸或其片段被提 供，优选地具有至少30%的序列一致性，并且这些多核苷酸通过部分同源的体内重组被拼 接和重组，从而产生一种具有至少一个交叉的嵌合的核苷酸序列，优选地一种基因嵌合体。
[0054] 根据一个具体实施例，在一个单独的步骤程序中
[0055]a)将该细胞用所述全长的多核苷酸或片段的混合物进行转化；并且
[0056]b)将该嵌合的核苷酸序列在该细胞基因组的整合位点进行重组，
[0057] 其中
[0058]i)所述多核苷酸的5'-末端序列具有一种侧翼的靶序列，该靶序列正锚定到所述 整合位点的3' -端，并且
[0059] ii)所述多核苷酸的3' -末端序列具有一种侧翼的靶序列，该靶序列正锚定到所 述整合位点的5' -端，
[0060] 并且
[0061] c)选择包括一个基因嵌合体的克隆。
[0062] 具体地，提供了一种方法，其中这些多核苷酸中的至少一个是由不同多核苷酸的 片段构成的，其片段在一个单独的步骤程序中被拼接为一种嵌合的核苷酸序列，其中
[0063]a)将该细胞用所述多核苷酸进行转化；并且
[0064] b)将该嵌合的核苷酸序列在该细胞基因组的整合位点进行重组，
[0065] 其中
[0066] i)所述多核苷酸的5'-末端序列具有一种侧翼的靶序列，该靶序列正锚定到所述 整合位点的3' -端；并且
[0067] ii)所述多核苷酸的3' -末端序列具有一种侧翼的靶序列，该靶序列正锚定到所 述整合位点的5'-端；
[0068] 并且
[0069] c)选择包括一个基因嵌合体的克隆。
[0070] 具体地，编码一系列至少两种酶的多核苷酸以全长多核苷酸或不同起源的片段被 提供，其中
[0071]-该5' -末端序列是编码该系列中的第一个酶的多核苷酸的；并且
[0072]-该3' -末端序列是编码该系列中的最后一个酶的多核苷酸的。
[0073] 具体地，这些多核苷酸编码一系列酶并且这些全长多核苷酸或片段中的至少一个 是一种重组分子，该重组分子包括
[0074] a)-个5' -部分，其包括该系列中的第一个酶的核苷酸序列；
[0075] b)-个3' -部分，其包括该系列中的第二个酶的核苷酸序列；以及
[0076] c)在该5' -部分和该3' -部分之间的一个终止子序列和一个启动子序列。
[0077] 具体地，提供了至少两种重组分子，其中第一个重组分子的3' -部分与第二个重 组分子的5' -部分具有至少30%的序列同源性。
[0078] 根据本发明，进一步提供了一种重组分子，该重组分子包括
[0079]a)-个5' -部分，其包括多酶复合体的一系列酶中的第一个酶的核苷酸序列；
[0080]b)-个3' -部分，其包括该系列中的第二个酶的核苷酸序列；并且
[0081]c)在该5' -部分和该3' -部分之间的一个终止子序列和一个启动子序列。
[0082] 第一个和第二个酶可以是按照连续的酶促反应的顺序或不是，例如按照不同的顺 序。
[0083] 根据一个具体方面，该方法进一步包括生产细胞谱系，其在编码嵌合酶的基因嵌 合体中彼此不同。
[0084] 根据本发明，进一步提供了包括通过本发明的方法可获得的谱系的细胞文库，优 选的是包括至少100个不同的克隆、优选地至少200、300、400、500、1. 000、2. 000、3. 000、 4. 000、5. 000,或至少10. 000个克隆的文库。
[0085] 根据本发明，进一步提供了本发明的方法，该方法进一步包括产生包括苯丙烷、羟 基苯甲醛、香草素和/或香草醛生物合成的中间体的芳香族化合物的谱系。
[0086] 根据本发明，进一步提供了产生一种芳香族化合物文库的方法，该芳香族化合物 文库包括苯丙烷、羟基苯甲醛、香草素和/或其羟醛前体和/或香草醛生物合成的中间体， 该方法包括
[0087]-提供本发明的一种文库，具体地是一种克隆的文库和/或一种芳香族化合物的 文库，
[0088]-在初始前体化合物或一种或多种中间体前体化合物存在的情况下，培养所述文 库以产生作为代谢物的多种芳香族化合物。
[0089] 根据本发明，进一步提供了一种芳香族化合物文库，该芳香族化合物文库包括多 种通过本发明的方法可获得的代谢物，其中至少一种代谢物是人工的代谢物或非天然发生 的代谢物。
[0090] 根据本发明，进一步提供了本发明的细胞用于代谢物的异源生物合成的用途。具 体地，该产物是香草素或其羟基苯甲醛前体，优选地
[0091] -其中所述香草素选自下组，该组由以下各项组成：香草醛、香草酸、乙基-香草 醛、香草醇和香草醛-糖苷；和/或
[0092] -其中所述羟基苯甲醛前体选自下组，该组由以下各项组成：原儿茶醛、原儿茶 酸、儿茶醇、4-羟醛、4-羟基苯甲酸、4-羟基苄醇和咖啡酸。
[0093] 根据本发明，进一步提供了一种通过利用参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基 苯甲醛前体的生物合成的多酶复合体转化一种前体化合物进行的香草素或其羟基苯甲醛 前体的异源生物合成的方法，该多酶复合体包括用于香豆酸和巴豆酸酶的生物合成的酶， 优选地使用香豆酸作为前体用于香草醛的生物合成的至少所有酶，该方法包括
[0094] -提供一种本发明的细胞；
[0095] -在该前体化合物存在的情况下，在细胞培养物中培养所述细胞；
[0096] -累积生物合成的产物；并且
[0097] -从该细胞培养基分离所述产物。
[0098] 具体地，该多酶复合体包括
[0099] a)PAL、C4H、CPR、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶；或者
[0100] b)TAL、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶；或者
[0101] C)PAL/TAL、C4H、CPR、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶。
[0102] 具体地，本发明进一步提供了一种如在此所定义的分离的多酶复合体，特别是一 种包括以下项的多酶复合体
[0103] a)PAL、C4H、CPR、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶；或者
[0104] b)TAL、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶；或者
[0105] c)PAL/TAL、C4H、CPR、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶。
[0106] 具体地，所述前体化合物是一种天然氨基酸，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸，优 选苯丙氨酸或酪氨酸。
[0107] 具体地，所述前体化合物是单糖，优选地选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、 半乳糖或阿拉伯糖。
[0108] 具体地，所述产物是一种
[0109] -香草素，选自下组，该组由以下各项组成：香草醛、香草酸、乙基-香草醛、香草醇 和香草醛-糖苷；或者
[0110] -羟基苯甲醛前体，选自下组，该组由以下各项组成：原儿茶醛、原儿茶酸、儿茶 醇、4-羟醛、4-羟基苯甲酸、4-羟基苄醇、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸和阿魏酸。
[0111] 根据一个具体方面，所述产物是香草醛或香草醛的一种前体，优选地通过生物合 成（诸如通过体内反应）或化学反应（诸如通过体外反应）的酶