法将其进一步加工以产生 香草醛、或香草醛的衍生物，优选香草酸、乙基-香草醛或糖基-香草醛。
[0112] 具体地，本发明的方法提供了针对所述产物的高产率生产，例如具有产率为至少 10mg/L，优选地至少20mg/L、至少30mg/L、至少40mg/L、至少50mg/L、至少100mg/L或至少 200mg/L的该产物，例如在该培养基中获得产物浓度。
[0113]MM
[0114] 图1:香草醛生产细胞的合成途径。该图显示用以将苯丙氨酸转化为香草醛的示 意图。苯丙氨酸经受若干反应：苯环的4-位的脱氨基作用、羟基化，苯环的3-位的还原 链反应和羟基化，以及苯环的3-位的0-甲基化。CAR蛋白催化羧酸还原为其对应的醛。 PPTase的作用是将磷酸泛酰巯基乙胺从辅酶A转移至其受体CAR蛋白上。巴豆酸酶指代将 酰基-辅酶A上的第二和第三个碳之间的双键进行水合的一种酶。3-单加氧酶指代将一个 羟基基团结合至苯环的3-位中的底物中的一种酶。0-甲基转移酶指代将甲基基团从供体 转移至羟基受体的一种酶。
[0115] 图2 :用于将候选基团整合至酵母基因组中以便研究其功能性的策略。IF1包含 在酵母染色体的BUD31区域中的5' -插入位点和URA标记的5' -端，IF2包含3'端URA 标记和pGAL启动子。IF4包含tCYC终止子和LEU标记的5'端并且IF5包含LEU标记的 3'-端和在BUD31区域中的3'-插入位点。将合成的基因从GeneArt质粒中扩增。用于 扩增感兴趣的基因的上游寡核苷酸的5'-端包含具有与该pGALl启动子的3'-端同源的 40个核苷酸的序列。该下游寡核苷酸包含与该tCYC终止子的5' -端同源的40-nt序列。 通过在酵母转化体中的同源重组拼接后，该双重选择允许该重组体分离。重组后，该基因具 有允许其在酵母细胞中表达的一个启动子（pGAL)和一个终止子（tCYC)序列。
[0116] 图3:由包含同源基因序列的片段进行的香草醛途径的拼接。这个图显示包括用 于从苯丙氨酸起始的香草醛生产的6个基因的8个片段的共转化。URA3和LEU2是使得能 够对重组途径进行双重选择的侧翼标记。将每个基因的生物体来源在该基因的名字后用三 个字母来指示，该基因也以三个字母示出。将对应的生物体物种在左侧指示。
[0117] 图4 :Y00VAN上清液的紫外-可见光色谱图（290nm)。灰色线代表阴性对照菌株 并且黑色线代表Y00VAN。通过将它们与我们的化合物文库相比较来鉴定峰值。1)3-4二羟 基苯甲酸；2)香草醇；3) 3-4二羟基苯甲醛；4)香草酸；5)香豆酸；6) 4-羟基苯甲醛；7)香 草醛
[0118] 图5:香草酸和3-4二羟基苯甲酸在Y00VAN菌株中的累积。将培养进行60小时， 然后收获细胞并且将上清液通过HPLC进行分析。使用校准用基准溶液来推断香草酸和3-4 二羟基苯甲酸的浓度。该图显示在上清液中的香草酸和3-4二羟基苯甲酸依赖该生长条件 的累积。
[0119] 图6:CAR-PPTase-URA盒对ADH6基因的破坏。该图显示双顺反子构建至ADH6基 因座的拼接和整合。该重组细胞Y0CP允许活性CAR蛋白的表达并且内源的ald6被钝化。
[0120] 图7 :香草醛途径的包含部分同源基因序列片段的拼接。这个图显示包括用于从 苯丙氨酸起始的香草醛生产的6个基因的8个片段的共转化。基因PAL、C4H、ECH、HBH、C0MT 是具有给定同源度（少于99.5%)的相关的部分同源译本〇1〇1116〇1〇8〇118￥618；[011)。！1153 和LEU2是使得能够在MMR缺陷型酵母中转化后对重组途径进行双重选择的侧翼标记。将每 个基因的生物体来源在该基因的名字后用三个字母来指示，该基因也以三个字母示出。将 对应的生物体物种在左侧指示。
[0121] 图8 :阿魏酸生产细胞的合成途径。该图显示用以将苯丙氨酸转化为阿魏酸的示 意图。苯丙氨酸经受若干反应：苯环的3和4位的脱氨基作用、羟基化，以及苯环的3位的 ο-甲基化。
[0122] 图9 :PheA/Flared表达酵母的上清液的紫外-可见光色谱图（290nm)。PheA羟基 化香豆酸导致咖啡酸产生。灰色线代表Y00对照菌株；黑色线代表表达PheA/flared的细 胞并且用500μΜ香豆酸进料。
[0123] 图10 :阿魏酸途径的包含同源基因序列片段的拼接。该图显示包括用于从苯丙氨 酸起始的阿魏酸生产的5个基因的7个片段的共转化。URA3和LEU2是使得能够对重组途 径进行双重选择的侧翼标记。将每个基因的生物体来源在该基因的名字后用三个字母来指 示，该基因也以三个字母示出。将对应的生物体物种在左侧指示。
[0124] 图11 :参与如在图3、6和9所描述的代谢途径的多酶复合体的示例性酶的氨基酸 序列。
[0125] SEQID1 :美洲黑杨（Populusdeltoids)的PAL
[0126] SEQID2 :皱叶欧序（Petroselinumcrispum)的PAL
[0127] SEQID3 :大豆（Glycinemax)的C4H
[0128] SEQID4 :皱叶欧序（Petroselinumcrispum)的C4H
[0129] SEQID5 :美洲黑杨（Populusdeltoids)的 4CL
[0130] SEQID6 :焚光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens)的ECH
[0131] SEQID7 :棕色固氮菌（Azotobactervinelandii)的ECH
[0132] SEQID8 :铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginos)的HBH
[0133] SEQID9 :棕色固氮菌（Azotobactervinelandii)的HBH
[0134] SEQID10 :紫苜蓿（Medicagosativa)的C0MT
[0135] SEQID11 :扁叶香果兰（Vanillaplanifolia)的C0MT
[0136] SEQID12 :喜热·油芽胞杆菌（Geobacillusthermoleovorans)的PheA
[0137] SEQID13 :喜热·油芽胞杆菌（Geobacillusthermoleovorans)的FLARED
[0138] SEQID14 :伊文思诺卡氏菌（Nocardiaiowensis)的CAR
[0139] SEQID15 :伊文思诺卡氏菌室温PPTase
[0140] SEQID48 :简青霉（Penicilliumsimplicissimum)的VA0，P56216. 1GI:3024813
[0141] 图12 :与对照菌株相比，Y00VANCP菌株中的香草醛和中间体代谢物的累积。将培 养进行24小时，然后收获细胞并且将上清液通过HPLC进行分析。使用校准用基准溶液来 推断代谢物的浓度。
[0142] 图13 :香草醛途径的包含同源基因序列片段的拼接。这个图显示包括用于从苯丙 氨酸起始的香草醛生产的9个基因的8个片段的共转化。HIS3和LEU2是使得能够对重组 途径进行双重选择的侧翼标记。将每个基因的生物体来源在该基因的名字后用三个字母来 指示，该基因也以三个字母示出。将对应的生物体物种在左侧指示。
[0143] 发明详细说明
[0144] 相对于多核苷酸、基因或核酸，如在此所使用的术语"拼接"是指核苷酸序列的连 接或接合，例如连接至少两种序列，诸如它们的基因或部分，以获得基因拼接。在一些实施 例中，将线性合成核酸分子进行拼接。核酸分子可以作为线性核酸分子被提供或可以在体 内被线性化或从较大的核酸分子切除。
[0145] 通过基因或基因片段的拼接，可以获得一种呈单一核苷酸序列的复合基因或基因 簇。将这些基因例如串联在一起，任选地具有重叠。如在此所述的拼接可以具体地包括一 种或多种基因间和/或基因内的交叉或一种或多种基因嵌合体。
[0146] -种拼接的簇可以包含复制原点并且能够在宿主细胞中复制。在具体实施例中， 将该拼接的簇插入至宿主细胞基因组中。遗传组件的拼接可以通过同源重组的重复循环或 通过体内部分同源重组（诸如在此具体所述的）来实现。在不同的实施例中，一种拼接策 略涉及重组或连续几轮的重组，并且可以涉及一种或多种选择性标记。在一些实施例中，另 外的基因元件可以通过转染技术（诸如电穿孔）连续地引入至该宿主细胞中。又在另外的 实施例中，可以进一步将基因元件引入至该簇或宿主细胞基因组例如启动子或终止子序列 中。
[0147] 如在此所使用的术语"细胞"，具体关于进行工程化及将基因的拼接簇引入至一种 细胞或生产细胞，被理解为是指任何原核或真核细胞。根据本发明，原核生物的和真核生物 的宿主细胞两者均被考虑用于使用，包括细菌宿主细胞，像大肠杆菌或芽孢杆菌属；酵母宿 主细胞，诸如酿酒酵母；昆虫宿主细胞，诸如草地贪夜蛾；或人宿主细胞，例如海拉（HeLa) 和尤尔卡特（Jurkat)。
[0148] 优选的宿主细胞是单倍体细胞，诸如自念珠菌属（Candidasp)，毕赤酵母属 (Pichiasp)和酵母菌属（Saccharomycessp) 〇
[0149] 术语"细胞"应具体地包括一种单一细胞或在细胞培养物中培养的细胞，诸如细胞 系。
[0150] 根据本发明，任何野生型或修复缺陷型原核或真核细胞，包括具有核酸修复（诸 如DNA或RNA修复）中的缺陷的那些，可以被用来拼接这些多核苷酸。在野生型细胞中，选 择允许用于（部分同源的）重组的适合的整合位点。
[0151] 如在此所使用的术语"DNA修复缺陷型细胞"应是指一种DNA修复缺陷型原核或真 核细胞，具体是具有在核酸修复中的缺陷的那些，例如具有错配修复（MMR)系统的突变或 修饰的那些，或具有其他修复缺陷系统诸如DNA修复基因（例如radl、recQ)的完全或临时 敲除的那些。在不是DNA修复缺陷型的细胞中，损伤和错配的DNA通常被修复并且部分同 源序列的重组被抑制。MMR系统或其他DNA修复缺陷型系统的突变或修饰将会增强细胞中 的重组频率，从而优选地被用来拼接和/或重组如在此所述的多核苷酸，例如由此拼接多 核苷酸簇和/或提供具有基因嵌合体的嵌合核苷酸序列。
[0152] 作为一个实例，错配修复可以完全地或暂时地被敲除，或可以通过添加特异的底 物至该细胞培养基中来调节或诱导，其中在进行定向重组过程中或之后培养这些细胞。具 体地，细胞的MMR缺陷可以通过任何瞬时或永久性损害错配修复的策略来实现，包括参与 错配修复的基因的突变、用紫外线处理、用化学物质诸如2-氨基嘌呤处理、参与错配修复 的基因例如通过将会允许瞬时失活和活化的可调控的启动子的诱导型表达或阻遏。
[0153] 细菌的错配修复系统已经被广泛地研究。在其他系统例如酵母中，若干基因已经 被鉴定，在酿酒酵母中，这些基因的产物与细菌的错配修复蛋白共有同源性，这些细菌的错 配修复蛋白例如MutS蛋白的类似物，即Mshl、Msh2p、Msh3p、Msh4、Msh5、Msh6p，以及MutL 蛋白的类似物，即Mlhlp、Mlh2p、Mlh3p和Pms1。
[0154] 对于优选的错配修复缺陷型细胞的实例是特定的酵母细胞，诸如具有缺陷或（暂 时）失活的MSH2的酿酒酵母菌株，例如工程化的W303、BY、SK1菌株诸如MXY47 (具有经破 坏的MSH2的W303)菌株。
[0155]MMR的另外优选的系统是众所周知的细菌菌株的选择，诸如US5912119中所述的 那些，像例如mutS或mutL型的酶促MutHLS错配修复系统的缺陷株，其对于参与错配识别 的蛋白质MutS和MutL为缺陷型。优选的菌株是例如使用FmutL或大肠杆菌Hfr/鼠伤寒 沙门氏菌FmutL的重组体的鼠伤寒沙门氏菌。
[0156] 此外，根据本发明优选使用其他真核错配修复缺陷型细胞，像海拉（HeLa)和尤尔 卡特（Jurkat)细胞。
[0157]如在此所使用的术语"生产细胞"应具体地是指一种经重组工程化的细胞以产生 一种生产过程或生物合成的产物，例如代谢途径的产物。
[0158]如在此所使用的术语"细胞系"是指经长期实践已经获得增殖能力的特定细胞类 型的建立的克隆。术语"宿主细胞系"是指这样一种细胞系，如用于工程化和/或表达一种 内源或重组基因或代谢途径的产物以产生多肽或通过此类多肽介导的细胞代谢物。一种 "生产宿主细胞系"或"生产细胞系"通常理解为一种可立即使用的用于在生物反应器中培 养的细胞系以获得生产过程或生物合成的产物，诸如一种代谢途径的产物。
[0159]-旦选择产生所希望的生物合成产物的克隆，这些产物就典型地通过一种大规模 的生产宿主细胞系通过适合的表达系统及发酵来产生，例如通过细胞培养物中的微生物生 产。
[0160]如在此所述的，典型地拼接并且最终重组一种多核苷酸簇以在第一宿主细胞中例 如在DNA修复缺陷型细胞中获得嵌合序列。然后，该簇可以被转移至一个第二宿主细胞，该 第二宿主细胞具有不同的特性（例如稳定性）以经过长期生产时间产生高产率。此类第二 宿主细胞优选是一种生产宿主细胞。因此，该多核苷酸簇可以从用来工程化该簇的所述第 一宿主细胞中切除，并且然后整合至生产宿主细胞基因组中。
[0161]相对于一种多肽（诸如一种酶）或一种核苷酸序列（诸如一种编码酶的多核苷 酸），如在此所使用的术语"嵌合体"应是指包括至少两种异源部分的那些分子。在此上下 文中，异源表示这些部分未在体内的单一多肽或多核苷酸中的相同位置中发现。通常，这意 指这些部分衍生自至少两种不同的多肽或多核苷酸，例如自不同来源，诸如衍生自不同有 机体或物种的类似物。这些部分也可以通过一种来源（亲本）序列的诱变来获得。
[0162]具有多肽序列的不同重组的嵌合多肽可以源自一种或多种可能已经经受诱变的 亲本分子，因此可以包括突变，诸如一种或多种氨基酸的插入、缺失和/或替代。
[0163]具有基因或序列的不同重组的嵌合多核苷酸可以源自一种或多种可能已经经受 诱变的亲本基因，因此可以包括突变，诸如一种或多种核苷酸的插入、缺失和/或替代。
[0164] 在此上下文中，例如相对于起源的物种，术语"起源"或"不同起源"按以下方式被 理解。对于特定物种的细胞是分子异源的在此被理解为起源于所述物种，以天然发生的形 式（例如呈一种野生型分子及其异构体）或其片段或突变体。通过相对于另一个分子的不 同起源表征的分子被具体地理解为是指具有例如获自或衍生自不同物种的不同序列的分 子，诸如一种天然发生的分子，例如一种类似物、或提供呈一种人工或重组的分子，诸如呈 一种事实上不作为野生型分子存在的分子。
[0165]如在此所述的示例性酶是不同原核生物或真核生物起源的，例如任一种具有如列 于图10中的序列的酶或任一种如在下表中所述的酶：
[0166] 表1:用于拼接多酶复合体的示例性酶
[0167]
[0169] 如在此所述的一种嵌合酶具体地可以包括不同起源（例如来自不同物种）的类似 序列，因此，一种部分序列可以与衍生自一种具体物种的酶中的对应序列是同源的，然而其 他部分或区段可以与另一个物种中的对应序列是同源的。典型地，将该全长分子或此类分 子的部分进行重组并且任选地进行拼接以或获得一种嵌合分子。
[0170] 在一个具体实施例中，相对于该野生型酶，一种嵌合酶也可以是这样一种酶，其中 两种内源性部分序列的定位、间隔或功能已经例如通过操纵被改变。例如，一种序列的元件 可以通过添加、位移或去除核苷酸或氨基酸来重定位。可替代地，该氨基酸或核苷酸序列自 身可突变，例如以引入所希望的特性。典型地，此类特性包括增加该酶活性的能力。
[0171] 如在此所使用的术语"巴豆酸酶"应具体地是指在超家族中的酶，这些酶已经被示 出具有脱卤素酶、水合酶和异构酶活性，而其他已经被示出涉及碳-碳键形成和切割连同 硫代酯的水解。这些不同的酶共享对稳定衍生自酰基-辅酶A底物的烯醇化物阴离子中间 体的需要。这通过两种结构上保守的肽的NH基团来完成，这些NH基团向酰基-辅酶A底 物的羰基部分提供氢键并且形成一种"氧阴离子穴"。这些辅酶A硫代酯衍生物结合在典型 的钩形状中并且一个保守通道结合辅酶A的泛酰巯基乙胺基团，该泛酰巯基乙胺基团将该 3' -磷酸ADP结合位点连接至反应的位点。在巴豆酸酶超家族中的酶包括在阿魏酰辅酶A 或香豆酰辅酶A上催化地进行链还原反应的那些酶，例如烯酰-辅酶A水合酶（ECH，巴豆酸 酶；EC4. 2. 1. 17)，其催化2-反式-烯酰-辅酶A水合为3-羟酰基-辅酶A。
[0172] 如在此所使用的术语"苯丙氨酸氨解酶"(PAL)应具体地是指一种催化苯丙氨酸脱 氨反应的酶。在酶学中，一种苯丙氨酸氨解酶（EC4. 3. 1. 24)是这样一种酶，其催化L-苯丙 氨酸化学转化为反式-肉桂酸和氨。该类酶的分类名称是L-苯丙氨酸氨解酶（反式-肉桂 酸-形成）。通常所使用的其他名称包括酪氨酸酶、苯丙氨酸脱氨酶、酪氨酸氨解酶、L-酪 氨酸氨解酶、苯丙氨酸氨解酶、PAL和L-苯丙氨酸氨解酶。该酶参与五种代谢途径：酪氨 酸代谢、苯丙氨酸代谢、氮代谢、苯丙烷生物合成、和生物碱生物合成。如在此所使用的术语 "肉桂酸羟化酶"（C4H)应具体地是指一种催化肉桂酸4羟基化的酶，其是一种P450-依赖 性酶。C4H也被称为肉桂酸-4-羟化酶。[EC. 1. 14. 13. 11]
[0173] 如在此所使用的术语"细胞色素P450还原酶"（CPR)(也被称为NADPH:高铁血红 蛋白氧化还原酶，NADPH:血红素蛋白氧化还原酶，NADPH:P450氧化还原酶、P450还原酶、 POR、CPR或CYP0R)应具体地是指在真核细胞的内质网中从包含FAD和FMN的酶NADPH:细 胞色素P450还原酶进行电子传递至细胞色素P450所需要的膜结合酶（POR;EC1. 6. 2. 4)。
[0174] 如在此所使用的术语"酪氨酸氨解酶"（TAL，L_络氨酸氨解酶，或酪氨酸酶）应具 体地是指一种催化酪氨酸脱氨反应的酶（EC4. 3. 1. 23)。它参与天然苯酚生物合成途径。
[0175] 如在此所使用的术语"苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶"(PAL/TAL)应具体地是指一种催 化苯丙氨酸或酪氨酸脱氨反应的酶（EC.EC4. 3. 1. 25)。在酶学中，PAL/TAL催化L-苯丙氨 酸和L-酪氨酸的非氧化脱氨以形成分别具有相似效率的反式-肉桂酸和p-香豆酸。
[0176] 如在此所使用的术语"辅酶A连接酶"应具体地是指一种催化香豆酸或阿魏酸的 辅酶A酯化的酶。具体地，如在此所述的辅酶A连接酶是4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL; EC6. 2. 1. 12)，其催化4-香豆酸和辅酶A(CoA)的化学反应以获得呈一种产物的4-香豆 酸-辅酶A。该酶属于连接酶家族，具体地形成碳-硫键的那些酶，如酸-硫醇连接酶。该类 酶的分类名称是4-香豆酸：辅酶A连接酶（AMP-形成）。通常使用的其他名称包括4-香 豆酰-辅酶A合成酶、p-辅酶A连接酶、p-香豆酰辅酶A合成酶、p-香豆酰-辅酶A合成 酶、p-香豆酰-辅酶A连接酶、阿魏酰辅酶A连接酶、羟基肉桂酰辅酶A合成酶、4-香豆酸： 辅酶A连接酶、咖啡酰辅酶A合成酶、p-羟基肉桂酰辅酶A合成酶、阿魏酰辅酶A合成酶、 芥子酰（sinapoyl)辅酶A合成酶、4-香豆酰-辅酶A合成酶、羟基肉桂酸：辅酶A连接酶、 P-香豆酰-辅酶A连接酶、p-羟基肉桂酸：辅酶A连接酶和4CL。该酶参与苯丙烷生物合 成。
[0177] 如在此所使用的术语"3-单加氧酶"应具体地是指一种诸如通过羟基苯甲酸水 解酶（ΗΒΗ)催化4-羟基苯甲醛的羟基