组织结构体及其制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及由干细胞例如人工多能性干细胞、胚胎干细胞等未分化细胞发展成具有能够匹敌成熟组织的功能的组织结构体及其制作方法。【
背景技术：
】[0002]近年来，进行了如下尝试：使具有向各种功能细胞分化的能力的例如iPS细胞这样的多能性干细胞分化成具有目标脏器或细胞所特有的功能的细胞，将其用于创新药筛选、再生医疗（例如，非专利文献1)。但是，这只不过是将体内（invivo)的功能的一部分得以再现而已，其功能与生物体内的功能相比较显著地低。[0003]在创新药筛选试验中，要求表现出与在生物体内的试验即所谓的invivo试验同样的药物敏感性、毒性反应。为了在这样的用途中应用，上述的现有技术是不充分的，正在寻求一种更成熟化的、即表现出与生物体内的细胞所具有的功能相匹敌水平的功能的细胞。[0004]虽然在再生医疗领域中进行着脏器移植、人工脏器移植，但却存在有供体不足、排斥反应这样的问题。例如，对于严重的脏器衰竭，在临床现场进行脏器移植、利用人工脏器的置换治疗。但是，对于脏器移植而言，存在有排斥反应、绝对的供体不足；对于人工脏器而言，只不过是仅将功能的一部分短时间替代而已，等等（例如，专利文献1、2)，仍然存在着根本性的未解决问题。对于人为制造出人体组织而言，虽然可以考虑使用终末分化的细胞向单体（支架材料）进行细胞接种的方法等；但对于肝脏等具有复杂的高级功能的脏器，现状是还不存在确立的方法（非专利文献2)。[0005]这样，虽然正在寻求最终分化的成熟细胞或生物体组织，但现状是尚未实现。例如，对于肝功能，以下说明对成人体和现有的分化细胞进行比较的例。[0006]作为肝细胞的药物代谢酶之一的细胞色素P450具有57种基因，由此可知细胞具有非常多的功能。通过它们同时起作用或者根据需要起作用而维持生命。[0007]另外，可以确认，肝细胞中甚至到达80的基因的表达量随着从胎儿期至成为成人体而增加。进而，对于胰脏，非专利文献3、4中示出了在生成过程中，随着细胞成熟基因表达分布图发生变化。[0008]现有技术文献[0009]专利文献[0010]专利文献1:日本特开平9-56814号公报[0011]专利文献2:日本特开2004-166717号公报[0012]专利文献3:国际公开第2013/047639号[0013]专利文献4:国际公开第2007/058105号[0014]专利文献5:国际公开第2008/066199号[0015]非专利文献[0016]非专利文献1:MayaSchuldiner、等著〃Effectsofeightgrowthfactorsonthedifferentiationofcellsderivedfromhumanembryonicstemcells"、PNAS,97vol21、2000年10月10日（Publishedonline)、pp.11307-11312[0017]非专利文献2:BasakEUygun、等著〃Organreengineeringthroughdevelopmentofatransplantablerecellularizedlivergraftusingdecellularizedlivermatrix'NatMed,16(7)，2010年6月13日（Publishedonline)、pp.814-820[0018]非专利文献3:MartaSzabat、等著〃Kineticsandgenomicprofilingofadulthumanandmouseβ-cellmaturation"、Islets3:4、July/August2011、pp.175-187[0019]非专利文献4:GuoqiangGu、等著〃Globalexpressionanalysisofgeneregulatorypathwaysduringendocrinepancreaticdevelopment^Researcharticle、2003年9月30日、pp.165-178[0020]非专利文献5:FrancescoPampaloni、等著"Thethirddimensionbridgesthegapbetweencellcultureandlivetissue^NNaturereviewsmolecularcellbiologyvolume8、2007年10月、pp.839-845[0021]非专利文献6:MarkusRimann、等著〃Synthetic3Dmulticellularsystemsfordrugdevelopment^CurrentOpinioninBiotechnology201223、2012年、pp.1_7【
发明内容】[0022]发明要解决的问题[0023]然而，虽然公开了例如：专利文献3中记载的器官芽、专利文献4中记载的由未分化细胞诱导胰岛细胞的方法；专利文献5中记载的由未分化细胞向胰岛素分泌细胞的诱导方法等，但均是着眼于细胞功能中的一部分功能，对于个数有限的评价指标判断分化的有无。因此，这样的细胞、脏器不能判定为如上所述表达出多个基因模式的所谓的成熟水平。[0024]因此，使用通过现有的评价指标所判定的细胞、脏器来对药物的作用效果、毒性等进行判定的情况下，产生不能正确地预测生物体内的反应这样的问题、人工脏器不能充分地起作用这样的问题。[0025]发明人等发现，为了回避上述的问题，重要的是全面地捕捉这些最终分化的成熟细胞或生物体组织的蛋白表达、基因模式。[0026]用于解决问题的方案[0027]我们发明了以最终分化的成熟细胞或生物体组织的蛋白表达、基因表达模式的相似性作为指标的新的组织结构体及其制作方法。[0028]本发明的一实施方式的组织结构体是通过与从血管细胞、间充质细胞、由血管细胞分泌的因子、由间充质细胞分泌的因子、由血管细胞与间充质细胞两者存在而分泌的因子所组成的组中选择的至少一种细胞和/或因子一起，将来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞进行共培养而得到的；对于多种功能使用皮尔逊积差相关系数（Pearsonproduct-momentcorrelationcoefficient)测定出的值，所述组织结构体的该值相比于从胎儿采集的细胞或生物体组织更接近从成人体采集的细胞或生物体组织的值。[0029]另外，本发明的一实施方式的组织结构体优选的是，前述多种功能为10种以上的基因的表达量，前述10种以上的基因为前述组织结构体的基因表达量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的基因。更优选的是，例如：基因表达量是使用全部基因片段被固定的DNA芯片而分析的值；前述10种以上的基因为前述组织结构体的基因表达量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的全部基因。[0030]进而，本发明的一实施方式的组织结构体优选的是，前述多种功能为对10种以上的蛋白质测定的蛋白质量；前述10种以上的蛋白质为前述组织结构体的蛋白量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的蛋白质量改变20%以上的全部蛋白质。更优选的是，前述组织结构体为球状体形状，球状体的直径为50μm~2_。[0031]另外，前述多种功能优选为肝脏或胰脏所特有的功能。[0032]本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法是：（1)与从血管细胞、间充质细胞、由血管细胞分泌的因子、由间充质细胞分泌的因子、由血管细胞与间充质细胞两者存在而分泌的因子所组成的组中选择至少一种细胞和/或因子一起，将来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞进行共培养而制作培养形成物；(2)关于前述培养形成物所具有的多种功能，使用皮尔逊积差相关系数（Pearsonproduct-momentcorrelationcoefficient)进行测定；（3)提取测定的值相比于从胎儿采集的细胞或生物体组织更接近从成人体采集的细胞或生物体组织的值的培养形成物作为组织结构体。[0033]另外，本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，优选的是，前述多种功能为10种以上的基因的表达量，前述10种以上的基因为前述组织结构体的基因表达量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的基因；以及，前述组织结构体的提取是：测定前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞和前述培养形成物的基因表达量，选择具有10种以上前述培养形成物的基因表达量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的基因的培养形成物。更优选的是，例如：使用全部基因片段被固定的DNA芯片对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞与前述组织结构体的基因表达量进行分析时，前述10种以上的基因为组织结构体的基因表达量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的基因表达量改变2倍以上的全部基因。[0034]进而，本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，优选的是，前述多种功能为对于10种以上的蛋白质测定的蛋白质量，前述10种以上的蛋白质为组织结构体的蛋白量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的蛋白量改变20%以上的全部蛋白质；以及，前述组织结构体的提取是：测定前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞和前述培养形成物的蛋白质量，选择具有10种以上前述培养形成物的蛋白质量相对于前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞的蛋白质量改变2倍以上的蛋白质的培养形成物。[0035]另外，本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，前述共培养的工序优选包括：形成聚集体的工序；形成器官芽的工序；进而进行培养使器官芽成熟化的工序。在此基础上，在形成聚集体、形成器官芽、使器官芽成熟化的工序中，优选细胞彼此结合而聚集；在形成聚集体、形成器官芽、使器官芽成熟化的工序中，更优选细胞彼此结合而形成球状体形状的块。[0036]本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，前述细胞彼此形成的球状体的直径优选为50μm~2_。前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞优选为从来自胎生干细胞或人工多能性干细胞中选择的细胞，前述来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞更优选为能够从来自人工多能性干细胞的细胞分化成内胚层系列的细胞的细胞。[0037]另外，前述多种功能优选为肝脏或胰脏所特有的功能。[0038]本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，优选用当量直径为20μm以上且2.5mm以下、深度为20μm以上且1000μm以下的微容器培养前述组织结构体。在此基础上，优选使用培养表面为细胞非粘接表面的培养容器培养前述组织结构体。进而在此基础上，优选的是，前述培养容器的培养表面是与细胞接触的培养面且涂布有聚合物，所述聚合物包含从磷脂、磷脂?高分子复合物、聚甲基丙烯酸2-羟乙酯（PHEMA)、聚乙烯醇、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇和白蛋白的组中选择的一种或者它们的组合。[0039]本发明的一实施方式的组织结构体的制作方法中，优选的是，将血管细胞：来自干细胞的内胚层、外胚层或中胚层细胞：间充质细胞以10:7~10:1~2的比例进行共培养，并且以成为每1个微容器20个~2000个的密度接种细胞。另外，前述微容器是底部和开口部构成；前述开口部由包围自其与前述底部的边界至端部的区域的、锥角为1度以上且20度以下的壁构成；前述底部优选具有半球状与圆锥台的任一者的形状。[0040]发明的效果[0041]根据一实施方式，能够提供全面地捕捉最终分化的成熟细胞（由未分化细胞分化诱导的组织结构体）或生物体组织的蛋白表达、基因模式的组织结构体及其制作方法。【附图说明】[0042]图1是表不一实施方式的培养容器的一例的图。[0043]图2是表不从横向观察一实施方式的凹部的形状例的截面图。[0044]图3是表示从上面观察一实施方式的凹部的形当前第1页1 2 3 4 5