作为HSP27突变型（S135F）携带者的Charcot-Marie-Tooth病的动物模型的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及HSP27突变（S135F)介导的Charcot-Marie-Tooth病的动物模型。
【背景技术】
[0002] 对于开发新药和新的治疗方法来说，在以人为目标的研究中，使用动物模型的实 验是不可避免的，并且必须在对人进行治疗之前完成。但是，考虑到人疾病的数量很大，而 能够复制这样的人疾病的动物模型的数量非常小，这对新药和新的疾病治疗技术的开发而 言是很大的障碍。可根据使用目的，构建具有不同特征和作用的多种动物模型。迄今已知 的用于构建疾病动物模型的方法可分为三组。第一组方法是使用天然突变型形式作为动物 疾病模型的方法；第二组方法是通过给予化学品或移植经操作的细胞系来诱导疾病的实验 方法；以及，最新的方法是通过从分子遗传学途径快速发展出的基因移植进行的转染。对于 开发新药和新治疗方法的研究，基于用于稳固动物模型的各种不同研究方法及它们的协作 来建立有效的动物模型构建系统非常重要。
[0003] 遗传性周围神经病变主要分为三类：遗传性运动感觉神经病变（HMSN)、遗传性运 动神经病变（HMN)和遗传性感觉神经病变（HSN)。其中，大多数患者为遗传性运动感觉神经 病变，其也被称为Charcot-Marie-Tooth病（CMT)。Charcot-Marie-Tooth病由法国科学家 Charcot和Marie以及英国人Tooth于1886年首次鉴定。此后，该病以他们名字的首字母 命名为CMT。Charcot-Marie-Tooth病是在运动神经元和感觉神经元中具有缺陷的所有遗 传性疾病的总称，并且在罕见疾病中发病率最高（1/2500)。过去，该疾病被过于简单地理解 为由远端下肢中的肌肉萎缩引起的疾病。由于肌肉萎缩，患有该病的患者具有倒立的香槟 酒瓶状的腿。然而，该病现在被公认是综合征，而不是单一疾病。最近关于CMT的发病机制 已经有新的发现，这不仅对病理生理学研究有很大帮助，而且对复杂的临床类型和基因型 的分类有很大帮助。
[0004] 在过去几年的研究中，已通过基因克隆技术鉴定出关于遗传性运动感觉神经病变 的至少40个基因座，并且还已鉴定出至少20个致病基因。然而，经确认，许多遗传性运动 感觉神经病变患者与上述所鉴定出的基因座并不相关，这表明存在至少50个以上HMSN致 病基因。因此，对形成各种不同神经组织的成分均进行了鉴定。同样，预计可能存在多种类 型的遗传性神经病变，因为存在多种遗传性肌肉营养不良（musculardystrophies)。作为 CMT1A(HMSN的最常见类型）的潜在的合理药物疗法，奥那司酮（onapriston)、抗坏血酸和 NT-3(神经营养蛋白-3)在诊断和治疗方面引起了我们的关注。
[0005] 热休克蛋白（HSP)作为分子伴侣和抗细胞凋亡蛋白众所周知，在大多数细胞中表 达并在其中保存完好。根据氨基酸序列和分子量，热休克蛋白分为五组：l〇〇_ll〇kDa家族、 83-90kDa家族、66-78kDa家族、60kDa家族以及15-30kDa家族。HSP27属于小热休克蛋白 家族，在哺乳动物组织（包括肌肉组织和神经组织）中表达。HSP27广泛分布于运动神经元 和感觉神经元中。
[0006] HSP27是在细胞中以多种方式起作用的低分子量蛋白。该蛋白自身形成集落以自 卫抵御外界环境刺激（例如自由基或毒素）。
[0007] 本发明人试图开发出用于Charcot-Marie-Tooth病的疾病定制医学技术。结果， 本发明人从CMT患者来源的样品分离出成纤维细胞，由此构建出表达突变型HSP27 (S135F) 蛋白（其中，第135位的丝氨酸被替换为苯丙氨酸）的表达载体。在将所述表达载体注射入 接合子（zygote)后，本发明人将所述接合子植入到代孕母体中。然后，选择在基因组DNA中 携有所述表达载体的小鼠。结果，在携有表达突变型HSP27(S135F)蛋白的表达载体的小鼠 中确认了Charcot-Marie-Tooth病的表型。此后，本发明人确认了该Charcot-Marie-Tooth 病动物模型可有效地用于CMT治疗药物开发的前体筛选，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0008] 技术问题
[0009] 本发明的目的是提供HSP27突变（S135F)介导的Charcot-Marie-Tooth病动物模 型、其制备方法、以及使用所述动物模型进行的Charcot-Marie-Tooth病治疗药物候选物 的筛选方法。
[0010] 技术方案
[0011] 为了实现上述目的，本发明提供了Charcot-Marie-Tooth病（CMT)小鼠模型的接 合子，所述接合子引入有表达突变型HSP27蛋白（其中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨 酸被替换为苯丙氨酸）的表达载体。
[0012] 本发明还提供了通过将本发明的接合子植入到代孕母体的子宫中而获得的转基 因小鼠。
[0013] 本发明进一步提供了用于制备Charcot-Marie-Tooth病小鼠模型的方法，所述方 法包括以下步骤：
[0014] 1)构建能够表达突变型HSP27蛋白的表达载体，在所述突变型HSP27蛋白中，从N 末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸；
[0015] 2)将步骤1)的表达所述突变型HSP27的所述表达载体引入小鼠的接合子中；以 及
[0016] 3)通过将步骤2)中制备的所述接合子植入到代孕母体的子宫中，获得转基因小 ￡3 邱U
[0017] 另外，本发明提供了Charcot-Marie-Tooth病的预防性和治疗性物质候选物的筛 选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
[0018] 1)将样品给予本发明的转基因小鼠；
[0019] 2)对步骤1)的用所述样品处理的所述转基因小鼠中的突变型HSP27基因或蛋白 的表达水平进行测量；以及
[0020] 3)选择相比未经所述样品处理的对照组而言能够显著降低突变型HSP27基因或 蛋白的表达的样品。
【具体实施方式】
[0021] 在下文中，对本发明进行详细说明。
[0022] 本发明提供了Charcot-Marie-Tooth病（CMT)小鼠模型的接合子，所述接合子引 入有表达突变型HSP27蛋白（其中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨 酸）的表达载体。
[0023] 所述突变型HSP27蛋白（其中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯 丙氨酸）优选包含由SEQ.ID.NO: 1所表示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，但不总限于此。 为了获得所述突变型，将HSP27基因中编码所述丝氨酸的密码子TCC优选替换为编码苯丙 氨酸的密码子TTC或TTT。在本发明的优选实施方式中，编码所述丝氨酸的密码子更优选被 替换为TTC，但不总限于此。
[0024] 本发明还提供了通过将本发明的接合子植入到代孕母体的子宫中而获得的转基 因小鼠。
[0025] 所述转基因小鼠通过将本发明的接合子植入到代孕母体的子宫中而获得，所述接 合子表达突变型HSP27蛋白（其中，从N末端起第135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨 酸），并且，该小鼠模型优选具有诱发的Charcot-Marie-Tooth病，但不总是限于此。本发明 的转基因小鼠可通过常规的转基因小鼠制备方法来构建。
[0026] 在本发明的优选实施方式中，本发明人从CMT患者样品中得到HSP27mRNA。通 过PCR对所得到的HSP27mRNA进行扩增，以制备S135F突变型（参见图1A)。将扩增的 HSP27(S135F)蛋白克隆进表达载体（参见图1C)，并对其进行DNA测序。结果，确认了第 135位的氨基酸丝氨酸被替换为苯丙氨酸（参见图1D)。将所述HSP27(S135F)表达载体引 入用于转染的细胞系，随后对HSP蛋白的表达进行调查（参见图1E)。
[0027] 将构建的HSP27 (S135F)表达载体注射入小鼠的接合子，并将所述接合子移植到 代孕母体的子宫中。选择确认了HSP27(S135F)表达载体的表达的小鼠（参见图2)。然后， 进行旋转杆测试和握力测试。结果，确认了所构建的HSP27(S135F)突变型小鼠相比野生型 对照组而言，显示出显著下降的下肢力量（参见图5、图6和图8)，这表明在所述突变型小 鼠中确认了Charcot-Marie-Tooth病的表