AG
[0089] D0CK2-5R：AACAGCTATGACCATGTATGATGAGGGCTATTGACTGG
[0090] D0CK2-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGCAATATTTATTCTGCTTTCG
[0091] D0CK2-6R：AACAGCTATGACCATGGTCTCCTTTTTAAAGTCAAAGGG
[0092] -种检测D0CK2基因多态突变位点的试剂盒，包括
[0093] (i)血液DNA抽提试剂；
[0094] (ii)检测体系PCR反应液；
[00M] (iii)测序体系试剂；
[0096] 其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
[0097] 检测体系PCR扩增反应液包括：2XPCR Buffer;2mM dNTPs;K0D FX DNA 化171116^36(11]/41);000(2基因第6、22、33、37、40、44号外显子序列的上、下游引物000(2-1-F(ΙΟμΜ)、D0CK2-1-R(ΙΟμΜ)、D0CK2-2-F(ΙΟμΜ)、D0CK2-2-R(ΙΟμΜ)、D0CK2-3-F(ΙΟμΜ)、 D0CK2-3-R(ΙΟμΜ)、D0CK2-4-F(ΙΟμΜ)、D0CK2-4-R(ΙΟμΜ)、D0CK2-5-F(10yM)、D0CK2-5-R(10μ Μ)、D0CK2-6-F(ΙΟμΜ)、D0CK2-6-R(ΙΟμΜ)。
[009引测序体系试剂包括:测序纯化液化^1:0.611，(：1?:1.21])、抓了4(125111111〇1)、无水乙 醇、75%乙醇、HIDI(高度去离子甲酯胺）、测序引物:检测D0CK2基因第7、8、17号外显子序列 的上、下游引物分别为M13-F(3.2皿）、M13-R(3.2皿），W及Bigdye Terminator V3.U购买 自美国Applied Biosystems公司）。
[0099] 实施例2
[0100] 血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
[0101] (1)抽提血液中的组织DM: 1)抽取30化1血液加入90化1红细胞裂解液，颠倒混匀， 室溫放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12,0(K)rpm离屯、Imin，吸去上清，留下白细胞沉淀，加 200μ1缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μ1蛋白酶K溶液，混匀。3)加入20化1缓冲液GB， 充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短离屯、W去除管盖内壁的水珠。4)加入 200μ1无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离屯、W去除管盖内壁 的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）， 12，· 00化pm离屯、30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入50化1 缓冲液G D (使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12，0 0 0r P m离屯、3 0秒，倒掉废液，将吸附 柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入70化1漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无 水乙醇），12，OOOrpm离屯、30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加 入500μ1漂洗液PW，12，OOOrpm离屯、30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12， 00化pm离屯、2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残 余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μ1洗脱缓冲液TE，室溫放置2-5分钟，12，00化pm离屯、2分钟，将溶液收集到离屯、管中。
[0102] (2)试剂配置:按检测人份数配置检测体系PCR反应液各化1，每人份19μ1分装：
[0103] Χ = 19μ1反应液X (η份标本+1份空白对照）
[0104] η为检测标本数。
[01化](3)加样:加入检测体系PCR反应液中化1 DNA;空白对照加化1生理盐水或不加任 何物质。
[0106] (4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ΑΒΙ veriti(美国Applied Biosystems公司）等。反应条件如下：
[0107]
[0108] PCR扩增体系试剂配制方法如下：
[0109]
[011。 其中，引物序列为：[0112]
[0110]
[0113] (5)电泳:1.5 %琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。
[0114] 如图2、3、4、5、6、7所示，即为16例血液样本^000(2-巧/1?、000(2-2。/1?、000(2-3尸/ R、D0CK2-4F/R、D0CK2-5F/R、D0CK2-6F/R引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片 段长度分别为44化p、36化口、4376口、2906口、57化口、3186口，通过电泳图的分析表明本发明所 述 00邸2-1。/1?、000(2-2。/1?、000(2-3。/1?、000(2-4。/1?、000(2-5。/1?、000(2-6。/巧广增有效， 且条带单一。
[0115] (6) Sanger 测序：
[0116] 取化1 PCR产物与化1纯化体系。按照W下程序进行纯化：
[0117]
[011引将化1纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
[0122] 沉淀环节：
[0123] 向完成测序反应的产物中加入化1 125mmol的抓TA，静置5min;加入15μ1无水乙 醇，縱满混匀；3700rpm离屯、30min;倒置离屯、15sec，加入50μ170%乙醇，縱满混匀；3700rpm 离屯、15min;倒置离屯、15sec，置于95°C金属浴上;加入10μ1 Hi-Di后进行变性试验。变性程 序：
[0124]
[01巧]变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
[01%] (7)结果判断：分别将测序结果与D0CK2野生型参考序列（Genbank accn:NC_ 000005.10)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
[0127]实施例3
[01%]取16例的临床样本(样本编号为1-16)按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配 制试剂、扩增和测序。每份样本加入检测体系PCR反应液中化1。电泳结果如图2、3、4、5、6、7 所示，表明本发明所述引物 D0CK2-1F/R、D0CK2-2F/R、D0CK2-3F/R、D0CK2-4F/R、D0CK2-5F/ R、D0CK2-6F/R对血液样本能有效扩增，且条带单一。
[01巧]样本1、2、3、4、5、6的检测结果如图8、9、10、11、12、13所示：
[0130] 图8显示是样本1的D0CK26号外显子野生型测序截图，说明样本1的6号外显子未发 生突变。
[0131] 图9显示是样本2的D0CK222号外显子野生型测序截图，说明样本2的22号外显子未 发生突变。
[0132] 图10显示是样本3的D0CK233号外显子野生型测序截图，说明样本3的33号外显子 未发生突变。
[0133] 图11显示是样本4的D0CK237号外显子野生型测序截图，说明样本4的37号外显子 未发生突变。
[0134] 图12显示是样本5的D0CK240号外显子野生型测序截图，说明样本5的40号外显子 未发生突变。
[0135] 图13显示是样本6的D0CK244号外显子野生型测序截图，说明样本6的44号外显子 未发生突变。
[0136] 从检测结果可W看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展 出D0CK2基因第6、22、33、37、40、44号外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可^ 准确的扩展出D0CK2基因第6、22、33、37、40、44号外显子，无论是野生型还是突变型。对阳性 标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出D0CK2基因突变。
【主权项】
1. 检测D0CK2基因多态热点突变情况的引物，其特征在于，包括： 扩增D0CK2基因的引物，其碱基序列为： D0CK2-1 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGGGTTGTTTCTTGTCTCCT D0CK2-1 R：AACAGCTATGACCATGCCATCGGAAGTAGGTTAAATGAG D0CK2-2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTAACCTTTGATTGAATGCCT D0CK2-2 R：AACAGCTATGACCATGTAGGTTGGATTCTTGAGCTGTTT D0CK2-3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCGCCGAACTGTTTTAT D0CK2-3 R：AACAGCTATGACCATGGAGAAAGAGGCTAAGCAAATACA D0CK2-4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATCCAGGGAGGAGGACTTT D0CK2-4 R：AACAGCTATGACCATGCTCTTCAACTTGCTGTGAGGC D0CK2-5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTACTGGCTGCTTTACGAG D0CK2-5 R：AACAGCTATGACCATGTATGATGAGGGCTATTGACTGG D0CK2-6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGCAATATTTATTCTGCTTTCG D0CK2-6 R:AACAGCTATGACCATGGTCTCCTTTTTAAAGTCAAAGGG。2. 如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为： 检测D0CK2基因的测序引物喊基序列为： Ml3 F：TGTAAAACGACGGCCAGT M13 R:AACAGCTATGACCATG。3. 如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列D0CK2-1F和D0CK2-1 R是扩增D0CK2 基因第6外显子序列的引物，引物序列D0CK2-2 F和D0CK2-2 R是扩增D0CK2基因第22外显子 序列的引物，引物序列D0CK2-3 F和D0CK2-3 R是扩增D0CK2基因第33外显子序列的引物，弓丨 物序列D0CK2-4F和D0CK2-4 R是扩增D0CK2基因第37外显子序列的引物，引物序列D0CK2-5 F和D0CK2-5 R是扩增D0CK2基因第40外显子序列的引物，引物序列D0CK2-6 F和D0CK2-6 R 是扩增DOCK2基因第44外显子序列的引物。4. 如权利要求2所述的引物，其特征在于，引物序列M13-F和M13-R是测序DOCK2基因扩 增产物包含第6、22、33、37、40、44号外显子序列的引物。5. 检测DOCK2基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤： (1) 抽提血液中的组织DNA; (2) 用PCR扩增步骤1中提取的DNA; (3) 对步骤2中的扩增产物进行测序； (4) 对测序结果进行判断，确定DOCK2基因是否发生突变； 其中PCR扩增引物为： DOCK2-1 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGGGTTGTTTCTTGTCTCCT DOCK2-1 R：AACAGCTATGACCATGCCATCGGAAGTAGGTTAAATGAG DOCK2-2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTAACCTTTGATTGAATGCCT DOCK2-2 R：AACAGCTATGACCATGTAGGTTGGATTCTTGAGCTGTTT DOCK2-3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCGCCGAACTGTTTTAT DOCK2-3 R：AACAGCTATGACCATGGAGAAAGAGGCTAAGCAAATACA DOCK2-4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATCCAGGGAGGAGGACTTT D0CK2-4 R：AACAGCTATGACCATGCTCTTCAACTTGCTGTGAGGC D0CK2-5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTACTGGCTGCTTTACGAG D0CK2-5 R：AACAGCTATGACCATGTATGATGAGGGCTATTGACTGG D0CK2-6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGCAATATTTATTCTGCTTTCG D0CK2-6 R:AACAGCTATGACCATGGTCTCCTTTTTAAAGTCAAAGGG。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为： Ml3 F：TGTAAAACGACGGCCAGT M13 R:AACAGCTATGACCATG。
【专利摘要】本发明公开了检测骨髓增生异常综合征，特别是检测骨髓增生异常综合征患者DOCK2基因突变的引物和方法，其包括(i)扩增DOCK2基因第6、22、33、37、40、44号外显子序列的引物；采用Sanger测序技术和测序引物。本发明可快速地将骨髓增生异常综合征患者体内DOCK2基因第6、22、33、37、40、44号外显子的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助诊断重症联合免疫缺陷病，对早期干预及早期治疗有重要的参考意义。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105506107
【申请号】CN201511025636
【发明人】林筱剑, 林有升, 王淑一
【申请人】杭州艾迪康医学检验中心有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月30日