耳病病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测试剂盒。
[0012]本发明所采取的技术方案是:
一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分:多色荧光定量PCR MIX、核酸提取液、反转录酶系、Taq酶系、阳性质控品和阴性质控品，所述多色荧光定量PCR MIX中含有同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的特异性引物及探针，序列分别为:
猪瘟病毒
上游引物:CSFV-F:5’ -CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’ (SEQ ID N0.1)；
下游引物:CSFV-R:5’ -CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’ (SEQ ID N0.2)；
荧光探针:CSFV-P:5’ -FAM-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.3)；
高致病性猪蓝耳病病毒
上游引物:PRRSV-MF:5’ - AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’ (SEQ ID N0.4)；
下游引物:PRRSV-MR:5’ - GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’ (SEQ ID N0.5),
荧光探针:PRRSV-MP:5’ -VIC- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC - BHQ1-3’ (SEQ IDN0.6)； 伪狂犬病毒
上游引物:PRV_F:5’ -CCATGTGTGCCACTAGCATT-3’ (SEQ ID N0.7)；
下游引物:PRV-R:5’ -CCCCATCGCGGTTTTAA-3，(SEQ ID N0.8)；
荧光探针:PRV_P:5’ -CY5-TTCCTGATTCACGCCCACG- BHQ2-3’ (SEQ ID N0.9)；
猪圆环病毒2型
上游引物:PCV2-MF:5’ - ATAATCAAAAAGGGAGATTGGAAGCT-3’ (SEQ ID N0.10)；
下游引物:PCV2-MR:5’ -GGTGGGTGTTCACGCTGAA-3’ (SEQ ID N0.11)；
荧光探针:PCV2-MP:5’-ROX- CCGTATTTTCTTGCGCTCGTCTTCGG-BHQ3-3’ (SEQ IDN0.12)。
[0013]进一步的，上述多色荧光定量PCR MIX还含有1X多色荧光定量PCR buffer、dNTPSο
[0014]进一步的，上述多色荧光定量PCR MIX具体成分及含量为:
1X多色荧光定量PCR buffer2.5μ1
CSFV-F (ΙΟμΜ)?μ?
CSFV-R (ΙΟμΜ)?μ?
PRRSV-MF (ΙΟμΜ)?μ?
PRRSV-MR (ΙΟμΜ)?μ?
PRV-F (ΙΟμΜ)?μ?
PRV-R (ΙΟμΜ)?μ?
PCV2-MF (ΙΟμΜ)?μ?
PCV2-MR (ΙΟμΜ)?μ?
CSFV-P (ΙΟμΜ)0.5μ1
PRRSV-MP (ΙΟμΜ)0.5μ1
PRV-P (ΙΟμΜ)0.5μ1
PCV2-MP (ΙΟμΜ)0.5μ1
dNTPS (1mM)?μ?
ddH206.5μ1
Total20.0 μ I ο
[0015]进一步的，上述10Χ多色荧光定量PCR buffer中含有以下成分:500mMTris-HCl(ρΗ8.0)、30mM MgCl2,250mM KCl 以及 15%(v/v)的 DMSOUOU 的 RNaseOut (U)。
[0016]进一步的，上述核酸提取液含有50mM Tris-HCl, 0.7M NaCl, 1mM EDTA，3M的异硫氰酸胍和ImM的DTT。
[0017]一种同时检测猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的四色荧光定量PCR联合检测的方法，利用上述所述的检测试剂盒进行检测，具体包括以下步骤:
O提取待测样品中的病毒核酸；
2)以得到的核酸为模板进行四色荧光定量PCR检测，其中猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的的荧光探针报告基团均不相同；
上述荧光定量PCR反应体系为每25 μ I中含有多色荧光定量PCR MIX 20μ1、反转录酶系0.5μ1、Taq酶系0.5μ1以及提取的核酸模板或者阳性质控品或者阴性质控品4μ1 ；
荧光定量PCR反应的条件为:93?95°C 2分钟，然后93?95°C 5?10秒，58°C 45秒，采集荧光信号，40个循环；
3)结果分析:反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型阳性；
上述检测方法用于非病的诊断和冶疗。
[0018]本发明的有益效果是:
本发明方法和试剂盒能够同时检测出待测标本中猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型这4种感染猪的病毒，应用极为方便。优化的引物探针以及多色荧光定量PCR MIX，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高容易漏诊和误诊的问题，基于上述优点，该试剂盒适合在各级农产品检验检疫机构大规模筛查的推广应用，具有广泛的应用前景。
[0019]本发明试剂盒，可方便地同时检测出猪体内的多种常见病毒，准确率高，具有广泛的应用前景；且操作简便，特异性强，对临床样品的快速诊断及流行病学调查具有很强的实用价值。
【附图说明】
[0020]图1为多色荧光PCR体系中CSFV检测的敏感性实验，从左到右依次为1X106、I X 105、I X 14UX 13UX 12拷贝/ μ I的标准品的扩增结果O
[0021]图2为多色荧光PCR体系中PRRSV-M检测的敏感性实验，从左到右依次为I X 106、I X 105、I X 14UX 13UX 12拷贝/ μ I的标准品的扩增结果O
[0022]图3为多色荧光PCR体系中PRV检测的敏感性实验，从左到右依次为1Χ106、I X 105、I X 14UX 13UX 12拷贝/ μ I的标准品的扩增结果O
[0023]图4为多色荧光PCR体系中PCV-2检测的敏感性实验，从左到右依次为I X 106、I X 105、I X 14UX 13UX 12拷贝/ μ I的标准品的扩增结果O
[0024]图5为多色方法PCR体系中CSFV的特异性实验图，CSFV组织样本为阳性，PRRSV-CH1R 株疫苗、PRRSV-JXAl 株疫苗、PRRSV-HuM 株疫苗、FMDV-O 型疫苗、FMDV-Al 型疫苗、JEV组织样本、PRV组织样本、PRV疫苗、PCV-2组织样本及阴性质控品均为阴性。
[0025]图6为多色荧光PCR方法中PRRSV-M的特异性实验，PRRSV-JXAI株疫苗、PRRSV-HuM株疫苗为阳性，PRRSV-CH1R株疫苗、CSFV组织样本、FMDV-O型疫苗、FMDV-Al型疫苗、JEV组织样本、PRV组织样本、PRV疫苗、PCV-2组织样本及阴性质控品均为阴性。
[0026]图7为多色方法PCR体系中PRV的特异性实验图，PRV组织样本、PRV疫苗为阳性，PRRSV-JXAI株疫苗、PRRSV-HuM株疫苗、PRRSV-CH1R株疫苗、CSFV组织样本、FMDV-O型疫苗、FMDV-Al型疫苗、JEV组织样本、PCV-2组织样本及阴性质控品均为阴性。
[0027]图8为多色荧光PCR方法中PCV-2的特异性实验，PCV-2组织样本为阳性，图中起峰值的为PCV-2的2个复孔，PRRSV-JXAI株疫苗、PRRSV-HuM株疫苗、PRRSV-CH1R株疫苗、CSFV组织样本、FMDV-O型疫苗、FMDV-Al型疫苗、JEV组织样本、PRV组织样本、PRV疫苗及阴性质控品均为阴性。
【具体实施方式】
[0028]实施例1
1、特异性引物及探针的设计
用于检测猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M)、伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的引物和探针序列如下:
猪瘟病毒(CSFV)的
上游引物:CSFV-F:5’ -CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’ (SEQ ID N0.1)；
下游引物:CSFV-R:5’ -CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’ (SEQ ID N0.2)；
荧光探针:CSFV-P:5’ -FAM-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.3)
和
高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M)的