一种三重rt-pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种三重RT-PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胃肠炎病毒（PEDV)感染的主要症状为呕吐、带严重恶臭的水样腹泻，体 重下降及严重脱水。5周龄以上猪死亡率较低，在成年猪上发病温和，可能出现食欲不振、腹 泻，哺乳母猪可能出现无乳。但2周龄以下的仔猪最易感染，且发病率与死亡率较高，可能 由饥饿，脱水和酸中毒引发死亡。本试剂盒适用于对猪流行性腹泻病毒的辅助诊断。
[0003] 猪流行性腹泻病毒（TGEV)感染的主要症状为水样腹泻，或者进食后呕吐；病猪体 温正常或稍高，精神沉郁，食欲减退或废绝；断奶猪、母猪常呈精神萎顿、厌食和持续性腹泻 大约一周，并逐渐恢复正常，少数猪恢复后生长发育不良；肥育猪在同圈饲养感染后都发生 腹与，一周后康复，死亡率1%-3%。
[0004] 猪A群轮状病毒（GAR)感染的主要症状为急性腹泻，仔猪多发，主要表现为精神委 顿、厌食、呕吐、腹泻、脱水、体重减轻等临诊症状。成年猪与育成猪多为隐性感染，是引起猪 胃肠炎的常见病因。本病最早于1943年在患腹泻的儿童中发现，1975年首次从猪中分离出 轮状病毒，目前本病呈世界性流行，轮状病毒病是一种人畜共患传染病，能侵害人类和许多 畜禽，不仅感染率高，发病率也相当高，对人类健康和畜牧业危害较大。
[0005] 目前，用于检测PEDV、TGEV和GAR的常用方法有病毒分离、荧光抗体检测、免疫组 织化学法、电镜、ELISA病原检测法和RT-PCR等。但是，病毒分离耗时耗力且比较困难；荧 光抗体检测和免疫组织化学法非特异性较高且需要荧光显微镜进行观察；ELISA病原检测 方法应用比较广泛，但相较PCR方法过程较为复杂；常规RT-PCR每次只能检测一种病原且 需要将RNA反转录后再次进行PCR，操作繁琐，容易造成气溶胶污染。
[0006] 因此本发明设计一种一步法三重RT-PCR检测试剂盒，简化操作步骤，只通过一步 PCR就能确定单一感染或混合感染，并能确诊感染病毒种类。该试剂盒具有操作简便、准确、 快速等优点。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种三重RT-PCR检测试剂盒，能够快速、准确的做出检测。
[0008] 本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：一种三重RT-PCR检测试剂盒，该试 剂盒由用于病毒RNA提取的A盒和用于RT-PCR检测的B盒构成，A盒内设有缓冲液RG 9 mL、缓冲液RF 3 mL、缓冲液RD 8 mL、缓冲液RW 12 mL、RNA洗脱液3 mL、50倍TAE电泳缓 冲液8 mL、染色液10 y L、上样缓冲液30 y L、Rnase-free吸附柱、收集管10个、离心管10 个和0.2 mL PCR管10个，B盒内设有扩增反应液220 yL、酶系10 yL;所述扩增反应液中包 括用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒的PCR引物组，所 述引物组由三组引物序列组成，用于猪流行性腹泻病毒检测的引物序列分别为SEQ ID N0: 1和SEQ ID N0:2;用于猪传染性胃肠炎病毒检测的引物序列分别为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4;用于猪A群轮状病毒检测的引物序列分别为SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6。
[0009] 所述三重RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤： 步骤一、模板RNA的提取 ① 、在已处理的样品中加入800 y L缓冲液RG，充分颠倒混匀后在室温下静置5min，制 得混合液I，备用； ② 、向混合液I中加入200 y L缓冲液RF，混匀后在温度为30°C下孵育lOmin，之后放 入温度为2-8°C，转速为12000rpm的离心机中离心15min，收集上清液，向上清液中加入 500 y L缓冲液RD，并在温度为15-30°C下孵育5min，制得混合液II，备用； ③ 、将混合液II转入套有收集管的Rnase-free吸附柱中，室温下静置2min后，放入转 速为12000rpm的离心机中离心lmin，弃去收集管中液体，再向Rnase-free吸附柱中加入 800 y L的缓冲液RW，室温下静置2min后，放入转速为12000rpm的离心机中离心lmin，弃去 收集管中液体，然后在转速为12000rpm的离心机中离心2min，以除去残留的洗涤液，备用； ④ 、将步骤③处理后的Rnase-free吸附柱放入离心管中，向吸附膜中央处滴加50 yL RNA洗脱液，室温下静置2min后，放入转速为12000rpm的离心机中离心lmin，收集上清液 即得模板RNA ; 步骤二、PCR扩增 (1 )、配液：取出扩增反应液，在室温下溶化并混合均匀，经离心后按每个反应扩增反应 液21. 5 y L、酶系1 y L的比例混合并搅拌均匀，制得反应液，备用； (2) 、加样：将反应液按22. 5 y L/管分装到各个PCR反应管中，向各个PCR反应管中分 别加入2. 5 y L样本、阴性对照液或阳性对照液中的一种，封闭后转移至核酸扩增区，备用； (3) 、PCR扩增检测：步骤（2)处理的PCR反应管放入PCR仪中扩增，制得扩增产物，扩增 条件为：升温48°C lOmin，预变性94°C 2min，变性94°C 10s，退火57°C 30s，延伸72°C 20s，30个循环，绘制溶解曲线72°C 5min ; 步骤三、电泳 向容器中加入琼脂糖和50倍稀释的TAE电泳缓冲液，且每克琼脂糖对应的50倍稀释 的TAE电泳缓冲液66. 7mL，将装有琼脂糖和50倍TAE电泳缓冲液的容器放入微波炉中溶 解，然后向容器中加入5 y L染色液，混合并搅拌均匀后制得琼脂糖凝胶液，将扩增产物置 于110~120V电压、50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果； 步骤四、结果判定 若阴性对照、空白对照的电泳泳道无条带或无199bp、499bp、330bp的条带，且阳性对 照在199bp、499bp或330bp任一处有明显条带，则检测结果有效，其中，被检样品出现199bp 扩增带为猪流行性腹泻病毒阳性，出现499bp扩增带为猪传染性胃肠炎病毒阳性，出现 330bp扩增带为猪A群轮状病毒阳性，出现2条或3条扩增带则为对应病毒混合感染，否则 为阴性。
[0010] 有益效果 一、本发明根据PEDV 因、TGEV感因和GAR F 7基因分别设计3对特异性引物， 扩增片段大小为199bp、499bp和333bp，使用者可直接通过电泳结果用肉眼进行判断。
[0011] 二、本发明的试剂盒特异性强、重复性好、操作方便快捷，一般4~6 h就能确诊单 一感染或混合感染，达到诊断和鉴别的双重目的。
[0012] 三、该试剂盒具有较高的灵敏性，猪流行性腹泻病毒的最低检测浓度为4. 3 ng/ y L、猪传染性胃肠炎病毒的最低检测浓度为3. 2 ng/ y L、猪A群轮状病毒的最低检测浓度 为 6. 1 ng/ y L〇
【附图说明】
[0013] 图1是本发明对PEDV、TGEV和GAR进行的一步法RT-PCR检测结果； 图2是本发明对PEDV、TGEV、GAR进行的特异性检测结果； 图3是本发明对PEDV、TGEV、GAR进行的可重复性检测结果； 图4是本发明对PEDV进行的灵敏性检测结果； 图5是本发明对TGEV进行的灵敏性检测结果； 图6是本发明对GAR进行的灵敏性检测结果。
【具体实施方式】
[0014] 一种三重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒由用于病毒RNA提取的A盒和用于RT-PCR 检测的B盒构成，A盒内设有缓冲液RG 9 mL、缓冲液RF 3 mL、缓冲液RD 8 mL、缓冲液 R