一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种抗性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴定周期短、可靠性高的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评 价小麦丛矮病品种抗性的方法，属于植物病害抗性鉴定技术。
【背景技术】
[0002] 小麦是小麦属植物的统称，是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物，最早起源 于中东的新月沃土地区。小麦是三大谷物之一，绝大部分作为食用，仅约有六分之一作为饲 料使用。小麦作为世界上总产量第二的粮食作物也是中国第二大粮食作物，在国人食品中 扮演着重要角色。据统计，在当前中国的口粮消费总量中，小麦占43%左右。近年来，世界 人口增长以及人们生活水平不断提高，粮食需求持续增长，与此同时，耕地逐渐减少、水资 源不足、小麦病害频发、生态环境恶化、自然灾害频发，以及饲料用粮和生物燃料耗粮增加 等给世界粮食供给带来了严峻的挑战，小麦生产在粮食安全的地位日益重要。
[0003] 小麦丛矮病是靠传毒媒介灰飞虱传播的病毒病，是西北和华北冬麦区的一种常发 性病害，小麦丛矮病的典型症状表现为叶片有黄绿相间条纹，分蘖增多，植株矮化，形成明 显的丛矮状。冬前感病株大部分不能越冬而死亡，冬前未显症和早春拔节后感病植株上部 叶片显条纹，一般不能抽穗而提早枯死，有的能抽穗，但穗小籽粒秕瘦，对产量影响较大。小 麦丛矮病在我国分布较广，陕西、甘肃、宁夏、内蒙古、山东、山西、河北、河南、江苏、浙江、新 疆、北京、天津等省（区、市)均有发生，为害程度因年份和地区而异。轻病田减产10%~20%， 重病田减产50%以上，甚至绝收。
[0004] 小麦丛矮病毒主要由灰飞虱传毒。在中国多数北方地区，灰飞虱一年发生3~4 代，2~3龄若虫在杂草根际或土缝中越冬。翌年3月中旬开始活动，集中危害新返青的杂 草嫩叶。4月上旬，冬麦返青或春麦出苗后由田埂转至麦田，靠田埂的虫口密度高，后渐向田 中扩散。4月下旬是越冬代成虫羽化盛期。6月下旬第一代成虫出现。小麦成熟后，灰飞虱 转至秋作物及田边杂草，再繁殖1~2代，于11月份迀移到田埂等杂草丛下土中越冬。灰 飞虱1~2龄若虫易获毒，成虫传毒能力最强，最短获毒时间12h，最短传毒时间20min，获 毒率及传毒率随吸食时间延长而提高。灰飞虱一旦获毒可终生带毒，但不经卵传播。病毒 在若虫体内越冬。在冬麦区，灰飞虱秋季从带病毒的越夏寄主上大量迀飞至麦田，造成早播 秋苗发病。越冬带毒若虫是毒源，翌年迀回麦田危害。近几年，随着小麦田灰飞虱发生数量 逐年上升，小麦丛矮病的发生和危害程度也越来越严重，已成为制约我国小麦生产的严重 病害，给我国的粮食安全带来了极大的挑战。
[0005] 目前，对小麦丛矮病的防治主要是使用农药防治传毒介体灰飞虱，但由于介体昆 虫种群数量大导致防治效果不佳，且存在环境污染。培育抗病品种是防治各类病害最为经 济、有效的手段。筛选、发掘和创新抗病种质是开展抗病育种的前提和基础，而抗性基因定 位和克隆，则为利用标记辅助选择等分子育种手段、加快和高效培育抗病品种提供了全新 而有利的工具。但迄今小麦丛矮病抗性QTL检测和遗传效应分析还处于起步阶段，在生产 上也没有发现对小麦丛矮病免疫的品种，所以对小麦丛矮病抗性种质进行大规模筛选和展 开小麦丛矮病抗性遗传特性研宄显得尤为迫切。
[0006] 筛选抗病资源应用于抗病育种生产是最为直接有效的方法，目前小麦育种上筛选 抗病品种、抗病基因定位鉴定抗性家系多采用田间自然发病鉴定法和人工接种传毒介体鉴 定法，但是自然鉴定方法鉴定不能排除排驱性对抗病鉴定结果的干扰，而人工接种传毒介 体鉴定法难以满足品种抗性鉴定所需传毒介体的规模量的需求，并且田间自然发病鉴定和 人工接种传毒介体鉴定均需要通过小麦越冬生长后才能进行表型鉴定，鉴定周期很长，限 制了该方法的推广应用。
[0007] 科学技术发展日新月异，用于检验鉴定植物病毒的技术也迅速发展，除了传统的 生物学方法、血清学方法、电子显微镜法、芯片检测法，新兴起的分子生物学方法给植物病 毒的鉴定提供了新思路。分子生物学方法主要是通过提取病毒的核酸（DNA、RNA)来检测病 毒的种类和存在。目前主要应用的定性检测分子生物学方法包括病毒核酸分子杂交技术、 dsRNA电泳技术和多聚酶链式反应（PCR)技术，定量检测主要是指实时荧光定量PCR技术。 此种方法灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作过程也比较简便、可用于大量样品检测。荧 光定量PCR在植物病毒检测与鉴定方面，能够定量检测病毒拷贝数。应用荧光定量PCR检 测未知样本时，相比其他定量方法和普通PCR方法特异性更强、准确性高、灵敏度高、线性 关系广、操作简单安全，样品的污染较底(样品的扩增和检测在同一管内进行)，且不需要后 期处理。由于荧光定量PCR法对检测未知样品含量的优越性，已经在诸多领域如植物病理 机制研宄，转基因研宄中的目标基因表达水平和医学临床检测方面得到了广泛和成熟的应 用。
[0008] 我们研宄发现对小麦植株接种RBSDV，不管是抗病还是感病小麦植株体内，均检测 到RBSDV病毒，另外小麦植株苗期感染RBSDV病毒之后，症状不凸显，不能通过表型确定其 抗病性，需要等到越冬显症后才能确定其抗病性。令人振奋的是，我们新近研宄发现小麦低 氧萌发所产生的胚芽鞘接种RBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的RBSDV病毒增殖速度与小麦 品种抗性直接相关。胚芽鞘是小麦胚芽外的锥形套状物，是一个鞘状结构，胚芽鞘本来是小 麦叶片的保护组织，有保护胚芽中更幼小的叶和生长锥的作用。通常小麦植株感染RBSDV 病毒都是在小麦苗期通过灰飞虱传毒的，故种子萌发产生胚芽鞘的传毒研宄被忽略，我们 研宄发现胚芽鞘接种RBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的RBSDV病毒增殖速度与小麦品种抗 性直接相关，这给小麦丛矮病的抗性鉴定提供了新思路。
[0009] 本发明通过胚芽鞘培养前期激素的低氧诱导和胚芽鞘培养后期激素的抑制培养 来拓展胚芽鞘的生长时间，而在此时间内通过荧光定量RT-PCR技术对接种病毒后胚芽鞘 内的RBSDV含量进行检测，通过制作RBSDV增殖趋势图实现了接毒后胚芽鞘内RBSDV病毒 增殖速度快速而准确地测量，进而快速鉴定小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平和抗性等 级。
[0010] 利用本方法评价小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平，既可以去除排趋性对鉴定结 果的干扰，又克服了常规鉴定方法周期太长、准确性低的缺陷，通过检测胚芽鞘内病毒增殖 速度快速评价小麦丛矮病品种抗性，具有鉴定周期短、可靠性高的优点。这一鉴定方法除了 可以应用于小麦品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育外，亦可以应用于抗病 基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研宄等众多领域。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是针对目前小麦丛矮病品种抗性鉴定方法具有鉴定周期长、鉴定结 果不准确等缺点，提供了一种鉴定周期短、可靠性高的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快 速评价小麦丛矮病品种抗性的方法。
[0012] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的： 一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种抗性的方法，其特征在 于：该鉴定方法包括以下步骤： 1) 选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对小麦丛矮病表现设置高抗、中抗、感 病三个鉴定标尺，选择三个相应小麦品种做为鉴定标尺； 2) 低氧诱导待测小麦和鉴定标尺品种的胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0. 6%次 氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25°C条件下适宜浓度的IAA 溶液中低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘； 3) 胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管 中，每个试管一个种子，定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h，将传 毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25°C条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水棉上 暗培养； 4) 荧光定量PCR获得各小麦品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达 量（RQ值）：按照周期时间点采集待测小麦和鉴定标尺特定位置的胚芽鞘40-60g，每个品种 每个取材时间点取材2-3重复，-70°C保存，提取RNA并纯化，取1 y L上述病毒RNA提取液， 加入荧光定量PCR反应体系，利用引物RBSDV-F:5'-AGA GCT CTT CTA GIT AIT GCG-3'和 RBSDV-R:5'-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3'按照荧光定量 PCR 扩增程序扩增 RBSDV 病 毒S7片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每 个取样时间点重复的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）； 5) 绘制RBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒 后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标， 对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Ae kx; 6) 根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平和抗 性等级：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线