公式y=Aekx评价待测小麦品种的抗性水平，即 公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低，待测品种k值小于等于高抗标尺的 为高抗品种，待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值 大于中抗标尺且小于等于感病标尺的为感病品种，待测品种k值大于感病标尺的为超感品 种。
[0013] 所述步骤1)和6)中的高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地小麦品种 资源中排名为9%-11% ;中抗鉴定标尺排名为23%-27% ;感病鉴定标尺排名为47%-53%。
[0014] 所述步骤2)中的适宜浓度的IAA溶液浓度为1. 5-2. 5 ymol/L ;所述的低氧诱导 方法为种子置于液面下5-lOcm处培养。
[0015] 所述步骤3)中的带毒灰飞虱的获取步骤为： 3. 1) RBSDV毒源获取：从小麦丛矮病重病区田间采集表现为小麦丛矮病症状的小麦幼 嫩病株，-70°C保存； 3. 2)传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用小麦幼苗饲养并传代； 3. 3)介体饲毒：饲毒时从_70°C冰箱中取出小麦丛矮病病株，常温放置3_5h使病株自 然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移 入保鲜盒内，将室内人工饲养的1. 5-2. 5龄灰飞虱若虫转入保鲜盒内的RBSDV毒源小麦上， 25°C饲毒48h后移除毒源，将灰飞虱转移到小麦幼苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱。
[0016] 所述步骤3)中的适宜浓度的ABA溶液浓度控制为40-60 y mol/L ;所述步骤3)中 的定量接种带毒灰飞虱控制为6-10虫/个胚芽鞘。
[0017] 所述步骤4)中的周期取样时间点为RBSDV传毒后4-10天内每隔1. 5-2. 0天均匀 分布的3-4个时间点；特定位置的胚芽鞘为胚芽鞘长度的正中间部位。
[0018] 所述步骤4)中的提取RNA的方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按 比例加入TRI-Reagent到1. 5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%， 4°C 12000Xg低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中。
[0019] 所述步骤4)中的纯化RNA的方法为：a)直接添加一体积（95%-100%)酒精到已经 溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b)转移到吸附柱中过滤（吸附柱置于收集管 中），然后12000Xg离心lmin，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c)加400 y 1 RNA Wash Buffer到离心柱中，12000Xg离心lmin;d)将80 yl配好的DNAase I cocktail buffer 直接加到离心柱中，25-37°C水浴加热离心柱15min，12000Xg离心30s ;e)添加400 y 1 RNA Prewash到吸附柱中，12000Xg离心lmin，收集过滤的液体，重复此步骤；f)添加700 yl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000Xg离心lmin，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个 新的RNase-free 1.5ml离心管中；g)至少添加25yl DNase/RNase-Free Water到离心管 基质中，最大速度离心lmin，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于-70°C超低温冰箱中。
[0020] 所述步骤4)中的焚光定量反应体系每20 y L中含：10 y L的2XqPCR mastermix (Promega)、1. 0 y L 的cDNA模板、8.2 y L 的 ddH20 以及 0?8y L 的 10剛引物RBSDV-R和RP ; 实时荧光定量？〇?扩增程序为：95°0预变性2!^11;951：变性158,601：退火158,721：延伸 20s，共进行40次循环；95°C变性15s，60°C退火lmin，95°C变性15s。
[0021] 所述步骤3. 3)中的RBSDV毒源小麦来源于步骤3. 1)中的表现为小麦丛矮病症状 的小麦幼嫩病株。
【附图说明】
[0022] 附图为对实施例所选择的鉴定标尺胚芽鞘传毒后周期取材点取材检测RBSDV浓 度变化所获得RBSDV增殖指数趋势图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0024] -种小麦丛矮病的分子鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤： 1)选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对小麦丛矮病表现设置高抗、中抗、感 病三个鉴定标尺，选择三个相应小麦品种做为鉴定标尺，其中，高抗鉴定标尺为室内接毒鉴 定中抗病表现在当地小麦品种资源中排名为9%_11%，中抗鉴定标尺排名为18%_22%，感病 鉴定标尺排名为47%-53% ; 2) 低氧诱导待测小麦和鉴定标尺品种的胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0. 6%次 氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25°C条件下1. 5-2. 5 y mol/ L的IAA溶液液面下5-lOcm处低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘； 3) 胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养： 3. 1) RBSDV毒源获取：从小麦丛矮病重病区田间采集表现为小麦丛矮病症状的小麦幼 嫩病株，_70°C保存； 3. 2)传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用小麦幼苗饲养并传代； 3. 3)介体饲毒：饲毒时从_70°C冰箱中取出小麦丛矮病病株，常温放置3_5h使病株自 然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移 入保鲜盒内，将室内人工饲养的1. 5-2. 5龄灰飞虱若虫转入保鲜盒内的RBSDV毒源小麦上， 该RBSDV毒源小麦即3. 1)中的表现为小麦丛矮病症状的分蘖盛期小麦病株，25°C饲毒48h 后移除毒源，将灰飞虱转移到小麦幼苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱； 3. 4)胚芽鞘接种带毒灰飞虱：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个 试管一个种子，按照6-10虫/个胚芽鞘的比例定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管 后平置，传毒24h ; 3. 5)胚芽鞘接毒后暗培养：将胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25°C条件下浸润了 40-60 y mol/L的ABA溶液的吸水棉上暗培养； 4) 荧光定量PCR获得各小麦品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达 量（RQ值）：灰飞虱传毒结束后4-10天内在每隔1. 5-2. 0天均匀分布的3-4个时间点采集 待测小麦和鉴定标尺胚芽鞘长度的正中间部位40-60g，每个品种每个取材时间点取材2-3 重复，-70°C保存，提取RNA并纯化，（RNA提取方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨 碎，按比例加入TRI-Reagent到1. 5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体积10%， 4°C 12000Xg低温离心1. 5min，然后小心转移上清到新的离心管中；RNA纯化方法为：a)直 接添加一体积（95%-100%)酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b)转移 到吸附柱中过滤(吸附柱置于收集管中)，然后12000 X g离心lmin，之后把吸附柱转移到新 的收集管中；c)加400 y 1 RNA Wash Buffer到离心柱中，12000Xg离心lmin ;d)将80 y 1 配好的DNAase I cocktail buffer直接加到离心柱中，25_37°C水浴加热离心柱15min， 12000Xg离心30s ;e)添加400 yl RNA Prewash到吸附柱中，12000Xg离心lmin，收集过滤 的液体，重复此步骤；f)添加700 yl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000Xg离心lmin，然 后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free 1. 5ml离心管中；g)至少添加25 y 1 DNase/RNase-Free Water到离心管基质中，最大速度离心lmin，被洗脱的RNA可以直接利 用或保存于-70 °C超低温冰箱中。）取1 y L上述病毒RNA提取液，加入荧光定量PCR反应 体系，利用引物 RBSDV-F:5' -AGA GCT CTT CTA GIT AIT GCG-3' 和 RBSDV-R:5' -TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3'按照荧光定量PCR扩增程序扩增RBSDV病毒S7片段，扩增完毕， 进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的 RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）； 5) 绘制RBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒 后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标， 对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx; 6)根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平和抗 性等级： 6. 1)待测品种抗性水平评价：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待 测小麦品种的抗性水平，即公