式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低； 6. 2)待测品种抗性等级划分：根据待测品种和鉴定标尺k值大小来评价待测品种的抗 性等级，即待测品种k值小于等于尚抗标尺为尚抗品种，待测品种k值大于尚抗标尺且小 于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺为感病品 种，待测品种k值大于感病标尺为超感品种。 实施例
[0025] 2015年，利用该发明的鉴定方法对征集得到的部分小麦品种资源进行了丛矮病抗 性鉴定。分别设置辐阿1号、阿勃、绿叶熟三个小麦品种做为高抗、中抗、感病鉴定标尺，其 中，辐阿1号在2013-2014年室内接毒鉴定中抗病表现在51个小麦品种资源群体中排名第 5,阿勃排名13,绿叶熟排名26。胚芽鞘采集时间点设置为接毒完成后第4、8、12、16天四个 时间点。
[0026] 实时荧光定量PCR获得每个品种周期取样时间点的RQ值，如表一所示：
【主权项】
1. 一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种抗性的方法，其特征 在于：该鉴定方法包括以下步骤： 1) 选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对小麦丛矮病表现设置高抗、中抗、感 病三个鉴定标尺，选择三个相应小麦品种做为鉴定标尺； 2) 低氧诱导待测小麦和鉴定标尺品种的胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0. 6%次 氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25°C条件下适宜浓度的IAA 溶液中低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘； 3) 胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管 中，每个试管一个种子，定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h，将传 毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25°C条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水棉上 暗培养； 4) 荧光定量PCR获得各小麦品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达 量（RQ值）：按照周期时间点采集待测小麦和鉴定标尺特定位置的胚芽鞘40-60g，每个品种 每个取材时间点取材2-3重复，-70°C保存，提取RNA并纯化，取IyL上述病毒RNA提取液， 加入荧光定量PCR反应体系，利用引物RBSDV-F:5'-AGAGCTCTTCTAGITAITGCG-3'和 RBSDV-R:5'-TCAGCAAAAGGTAAAGGAACG-3'按照荧光定量PCR扩增程序扩增RBSDV病 毒S7片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每 个取样时间点重复的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）； 5) 绘制RBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒 后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐标， 对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx; 6) 根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平和抗 性等级：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测小麦品种的抗性水平，即 公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低，待测品种k值小于等于高抗标尺的 为高抗品种，待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种，待测品种k值 大于中抗标尺且小于等于感病标尺的为感病品种，待测品种k值大于感病标尺的为超感品 种。
2. 根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种 抗性的方法，其特征在于：所述步骤1)和6)中的高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现 在当地小麦品种资源中排名为9%-11% ;中抗鉴定标尺排名为23%-27% ;感病鉴定标尺排名 为 47%-53%。
3. 根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种 抗性的方法，其特征在于：所述步骤2)中的适宜浓度的IAA溶液浓度为1. 5-2. 5ymol/L; 所述的低氧诱导方法为种子置于液面下5-lOcm处培养。
4. 根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种 抗性的方法，其特征在于：所述步骤3)中的带毒灰飞虱的获取步骤为： 3.I)RBSDV毒源获取：从小麦丛矮病重病区田间采集表现为小麦丛矮病症状的小麦幼 嫩病株，_70°C保存； 3. 2)传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用小麦幼苗饲养并传代； 3. 3)介体饲毒：饲毒时从_70°C冰箱中取出小麦丛矮病病株，常温放置3_5h使病株自 然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移 入保鲜盒内，将室内人工饲养的灰飞虱转入保鲜盒内的RBSDV毒源小麦上，25°C饲毒48h后 移除毒源，将灰飞虱转移到小麦幼苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱。
5. 根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种 抗性的方法，其特征在于：所述步骤3)中的适宜浓度的ABA溶液浓度控制为40-60ymol/ L;所述步骤3)中的定量接种带毒灰飞虱控制为6-10虫/个胚芽鞘。
6. 根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种 抗性的方法，其特征在于：所述步骤4)中的周期取样时间点为RBSDV传毒后4-10天内每隔 1. 5-2. 0天均匀分布的3-4个时间点；特定位置的胚芽鞘为胚芽鞘长度的正中间部位。
7. 根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种 抗性的方法，其特征在于：所述步骤4)中的提取RNA的方法为：取适量叶片加液氮于研钵中 迅速磨碎，按比例加入TRI-Reagent到I. 5ml离心管中，样品体积不应超过TRI-Reagent体 积10%，4°C12000Xg低温离心I. 5min，然后小心转移上清到新的离心管中。
8. 根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品 种抗性的方法，其特征在于：所述步骤4)中的纯化RNA的方法为：a)直接添加一体积 (95%-100%)酒精到已经溶解于TRI-Reagent的上清液中，漩涡混匀；b)转移到吸附柱中过 滤(吸附柱置于收集管中），然后12000Xg离心lmin，之后把吸附柱转移到新的收集管中； c)加 400 y I RNA Wash Buffer 到离心柱中，12000 Xg 离心 lmin;d)将 80 y 1 配好的 DNAase 1 cocktail buffer直接加到离心柱中，25_37°C水浴加热离心柱15min，12000Xg离心 30s ;e)添加400 y I RNA Prewash到吸附柱中，12000Xg离心lmin，收集过滤的液体，重复 此步骤；f)添加700 y I RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000 Xg离心lmin，然后从收集 管中小心转移吸附柱到一个新的RNase-free I. 5ml离心管中；g)至少添加25 y I DNase/ RNase-Free Water到离心管基质中，最大速度离心lmin，被洗脱的RNA可以直接利用或保 存于-70 °C超低温冰箱中。
9. 根据权利要求1所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品 种抗性的方法，其特征在于：所述步骤4)中的荧光定量反应体系每20yL中含：IOyL的 2 XqPCRmastermix(Promega)、1. 0yL的cDNA模板、8. 2yL的ddH20 以及 0? 8yL的IOMM 引物RBSDV-R和RP;实时荧光定量PCR扩增程序为：95°C预变性2min;95°C变性15s，60°C 退火15s，72°C延伸20s，共进行40次循环；95°C变性15s，60°C退火lmin，95°C变性15s。
10. 根据权利要求4所述的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种 抗性的方法，其特征在于：所述步骤3. 3)中的RBSDV毒源小麦来源于步骤3. 1)中的表现为 小麦丛矮病症状的小麦幼嫩病株。
【专利摘要】本发明公开了一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种抗性的方法，该方法步骤如下：1）选择鉴定标尺；2）低氧诱导待测小麦和鉴定标尺品种的胚芽鞘；3）胚芽鞘接种带毒灰飞虱后暗培养；4）荧光定量PCR获得各小麦品种周期时间点的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）；5）绘制RBSDV增殖指数趋势线；6）根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平和抗性等级。本发明通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价小麦丛矮病品种抗性，能够从分子水平上快速确定小麦品种对小麦丛矮病的抗性水平和抗性等级，鉴定周期短且可靠性高，具有较大的育种应用价值。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-70
【公开号】CN104789703
【申请号】CN201510256184
【发明人】不公告发明人
【申请人】王开
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月20日