0. 15 y L，浓度为5U/ y L的Pfu DNA聚合酶0? 12yL，2yL的 10XPCR Buffer，l. 2yL浓度为 25nmol/yL的MgCl2,0. 25yL 浓度为lOnmol/ y L的dNTP，加超纯水至总体积20 y L ;PCR反应程序为95°C 5min，25个循 环包括 94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s，最后 72°C 10min。
[0084] 效果验证：
[0085] 采用扩增微卫星分子标记的方法对本发明的效果进行验证与检测
[0086] 效果验证1.步骤为：为了确定以基因组扩增产物为模板进行微卫星标记扩增时， 发挥作用的模板来自本发明扩增产物还是存在于反应体系中的少量原始DNA模板或者连 接反应产物，本技术采用分别以稀释5000倍的基因组DNA原液、稀释1000倍的连接产物、 以及稀释50倍的基因组扩增产物为模板（由于酶切-连接反应与本发明操作均使用了基 因组DNA，它们分别稀释1000倍与50倍可使其中的基因组DNA浓度与稀释5000倍的基因 组DNA原液浓度一致，即含有等量的原始基因组DNA)，采用PCR法扩增2个鲫鱼微卫星分子 标记，PCR产物使用3 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。
[0087] 作为优选，所述的稀释5000倍的基因组DNA原液为：取10 y L鲫鱼初孵仔鱼基因 组DNA原液，加入49990 y L无菌双蒸水，混勾；
[0088] 所述的稀释1000倍的连接反应产物为：取10 y L本发明操作过程中的连接产物， 加入9990 y L无菌双蒸水，混勾；
[0089] 所述的稀释50倍的基因组扩增产物为：取采用本发明得到的鲫鱼基因组DNA扩增 产物10 y L，加入490 y L无菌双蒸水，混匀；
[0090] 所述的1 %琼脂糖凝胶为：取0. 3g琼脂糖粉，加入30ml 1 X TBE缓冲液；电泳时间 20分钟，电压100V。
[0091] 效果验证2.步骤为：使用超纯水将采用本方法扩增的基因组DNA稀释50倍，作为 微卫星分子标记扩增的模板，PCR法扩增1个鲫鱼微卫星分子标记；取2 y L PCR扩增产物 经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图5所示。
[0092] 所述的扩增微卫星分子标记的方法为：反应体系包括PCR模板1 y L (将扩增的基 因组DNA稀释50倍），微卫星分子标记上游引物（10 y mol/L) 0? 1 y L，下游引物（10 y mol/ L)0.1yL，Taq DNA 聚合酶（5U/yL) 0.1 yL，10 XPCR Buffer lyL，MgCl2(25nmol/ yL)1.6yL，dNTP(10nmol/yL)0. 2yL，加超纯水至总体积10yL。PCR反应程序为：首先 95°C 5min，30 个循环包括 94°C 30s，退火温度 30s，72°C 30s，最后 72°C lOmin。
[0093] 经过检测，所述的2个鲫鱼微卫星分子标记为：
[0094] HLJYJ055-F：CCCTGACACACTGTCTGACC
[0095] HLJYJ055-R :TGAGCCTTTAACTCAGCATCC(GeneBank登录号：FJ827533);
[0096] HLJYJ028-F：GCTGCTTTTAGGAAAACTAGCTG
[0097]HLJYJ028-R :TTTCCTCCACCAACAAAACT(GeneBank登录号：FJ827516) 〇
[0098] 所述的1个鲫鱼微卫星分子标记为：
[0099] HLJY012-F：GCTTGTTTTGCTGCTCAAGA
[0100] HLJY012-R:ATATGACTGGGCCACAGAGG(GeneBank登录号：DQ378981);
[0101] 实验结论：
[0102] 采用本发明所述的方法抽提的基因组DNA比较干净、完整，无拖带现象，符合下一 步试验要求；
[0103] 采用本发明所述的方法对基因组DNA进行限制性酶切，酶切片段均大于100bp，主 要集中于250_1500bp，符合4碱基内切酶Taq I的预期酶切片段大小，酶切效果较好；采用 本发明所述的方法扩增基因组DNA，可大量增加基因组DNA的数量。
[0104] 酶切时使用高频限制性内切酶，产生较小的酶切片段，扩增时使用高保真的Pfu DNA聚合酶，减小PCR过程中的扩增错误；在PCR扩增未进入平台期即停止扩增，减小PCR 后期出现错配的可能；本发明建立的基因组扩增方法可解决大规模微卫星分子标记分析时 DNA模板数量不足的问题，本发明与FIASCO法（FastIsolationbyAFLPofSequences Containingrepeats)采用相同的内切酶，即能够消除以扩增的基因组DNA做模板时由于 微卫星位点被内切酶酶切而导致微卫星标记扩增失败的情况。
[0105] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种扩增鱼类基因组DNA的方法，其特征在于：所述的扩增鱼类基因组DNA的方法 按照以下步骤进行： 第一步、提取鱼类样品中的基因组DNA ; 第二步、使用限制性内切酶酶切鱼类的基因组DNA，限制性内切酶为：TaqI; 第三步、酶切DNA片段连接特定的寡核苷酸接头，并根据酶切位点序列与接头序列设 计特定引物；酶切位点序列为：5' -AGCT-3';寡核苷酸接头为：adaptor-F:5' -GACGATGA GTCCTGAG-3' ，adaptor-R:5' -CGCTCAGGACTCAT-3，； 第四步、采用PCR法扩增酶切片段，以此增加鱼类的基因组DNA的数量；所述的PCR引 *S:primer:5'-GATGAGTCCTGAGCGA-3'〇2. 根据权利要求1所述的一种扩增鱼类基因组DNA的方法，其特征在于：第一步具体 步骤如下： ① 取一尾鱼类样品置于灭菌离心管中，待酒精挥发完毕后，加入400-600 y L STE裂解 液，8-10 y L浓度为20mg/mL的蛋白酶K，颠倒混匀，放置于55°C水浴或摇床上消化4h以上； ② 消化至澄清后，向消化液中加入2-4 y L浓度为4mg/mL的RNaseA，轻微颠倒混匀，并 放置于37°C水浴中消化0. 5-lh ; ③ 加入等体积酸：氯仿1:1轻微颠倒混勾，12000rpm离心10-12min，小心打开离心管并 吸取上清液至另一个已灭菌离心管中； ④ 加入2. 5倍体积的无水乙醇，轻柔颠倒，并置于4°C环境中30-35min，之后低温离心 机中4°C下12000rpm离心l〇-12min，小心吸弃上清液保留沉淀； ?加入200-300 111浓度为75%的乙醇洗涤沉淀，并于低温离心机中4°(：下12000印111 离心10-12min，离心完毕后用移液器吸干离心管中的酒精； ⑥自然风干l〇_15min，以无酒精挂壁为准，最后加入20-50 y L TE溶液溶解基因组 DNA，保存备用。3. 根据权利要求1所述的一种扩增鱼类基因组DNA的方法，其特征在于：第二步具体 步骤如下：反应体系为15 y L，包括200-250ng的50ng/ y L样品鱼基因组DNA，0. 5 y L浓度 为10u/yL的TaqI限制性内切酶，3yL10XTaqIbuffer，超纯水6.5yL;反应于65°C 酶切311以上，80°(：变性2〇-3〇1^11;酶切产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。4. 根据权利要求1所述的一种扩增鱼类基因组DNA的方法，其特征在于：第三步具体 步骤如下：使用T4连接酶将寡核苷酸接头连接在步骤二产生的酶切片段的两端，具体步骤 如下：连接反应体系为l〇y L，包括6 y L第二步中的酶切产物，I y L浓度为lU/y L的T4连 接酶，I y L 10 X T4 buffer，0? 5 y L浓度为50 y mol/L的Taq I接头，超纯水L 5 y L ;反应 程序为16°C孵浴10h，结束后4°C保存。5. 根据权利要求1所述的一种扩增鱼类基因组DNA的方法，其特征在于：第四步具 体步骤如下：采用PCR法扩增基因组DNA，PCR反应体系为20 y L，包括第三步的I y L连 接产物，浓度为50 y mol/L的TaqIprimer 0? 15 y L，浓度为5U/ y L的Pfu DNA聚合酶 0? 12yL，2yL 的 10XPCR Buffer，1.2yL 浓度为 25nmol/yL 的 MgCl2,0.25yL 浓度为 IOnmol/ y L的dNTP，加超纯水至总体积20 y L ;PCR反应程序为95°C 5min，25个循环包括 94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s，最后 72。(： 10min。
【专利摘要】本发明涉及一种扩增鱼类基因组DNA的方法，属于分子生物学领域；所述的扩增鱼类基因组DNA的方法按照以下步骤进行：第一步、提取鱼类样品中的基因组DNA；第二步、使用限制性内切酶酶切鱼类的基因组DNA，限制性内切酶为：TaqⅠ；第三步、酶切DNA片段连接特定的寡核苷酸接头，并根据酶切位点序列与接头序列设计特定引物；酶切位点序列为：5′-AGCT-3′；寡核苷酸接头为：adaptor-F:？5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，adaptor-R:？5′-CGCTCAGGACTCAT-3′；第四步、采用PCR法扩增酶切片段，以此增加鱼类的基因组DNA的数量；所述的PCR引物为：primer:？5′-GATGAGTCCTGAGCGA-3′；本发明在扩增时使用高保真的<i>Pfu</i>？DNA聚合酶，减小PCR过程中的扩增错误。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105132408
【申请号】CN201510536062
【发明人】武祥伟, 冷云, 李光华, 于虹漫
【申请人】云南农业大学, 云南省渔业科学研究院
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月28日