具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮功能的酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种具有催化甲醛缩合合成1，3_二羟基丙酮功 能的酶及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 1，3-二羟基丙酮（1，3-dihydroxyacetone)，是自然界存在的最简单的三碳酮糖， 用途比较广泛。1，3-二羟基丙酮本身具有防晒功能，能有效阻止皮肤中的水分过度蒸发到 空气中，对皮肤具有保湿、防晒和防止太阳中紫外线辐射的作用，因此1，3-二羟基丙酮可 以用作制造化妆品的原料。另外，1，3_二羟基丙酮是糖类在体内代谢的中间产物之一，它在 体内糖代谢过程中起着非常重要的作用，它可以降低猪体内脂肪，促进体内脂肪的消耗，减 少蛋白质的消耗，而使蛋白质的含量增加从而提高瘦肉率。1，3_二羟基丙酮还可以和角质 层的角朊作用形成一种色素，这种色素可以使白斑处的皮肤与正常的皮肤颜色相近从而使 白斑得到治疗，因此1，3-二羟基丙酮有色素促进剂的作用。1，3-二羟基丙酮可以作为一种 抗病毒试剂，如二羟基丙酮用于鸡胚胎培养中，能很大程度的抑制鸡瘟病毒的感染，而且可 以杀死51%以上的鸡瘟病毒，同时以1，3_二羟基丙酮为底物合成相应的1，3_二羟基丙酮 的衍生物并由此制成的药，具有抗艾滋病的作用。由于1，3-二羟基丙酮含有一个羰基和两 个羟基，所以它的化学性质活泼，广泛用于多种有机化合物的合成，所以它是一个重要的化 学合成中间体，广泛应用于化妆品制造、食品研制、医药和化学合成等行业。
[0003] 1，3-二羟基丙酮的生产方法有化学法和微生物法，化学法有催化氧化法和甲醛缩 合法。目前，商业上生产1，3-二羟基丙酮的方法是利用葡糖杆菌属类微生物发酵甘油制备 1，3-二羟基丙酮的微生物法，该法的优点是条件温和、专一性强、产率高，但是生产能力很 低，提纯工艺复杂，生产装置要求严格，大大增加了生产成本且易造成环境污染。催化氧化 法是利用贵金属制备金属催化剂，选择性地氧化甘油，从而得到1，3-二羟基丙酮，但此方 法采用的催化剂价格较高，副产物多，后续分离纯化难度大。早期研究的甲醛缩合法主要是 局限于采用无机碱作催化剂和以甲醛水溶液作原料合成1，3-二羟基丙酮，但由于甲醛在 反应初期发生醇醛缩合反应生成乙醇醛，还有甲醛水溶液的聚糖反应，产物中主要是C2~ C7的直链糖和支链糖，其组分多达47种，以及糖分子内和糖分子间的羰基重排可逆反应 等，导致副反应很多，无法通过普通方法进行分离提纯，DHA的选择性低于10%。即使甲醛 缩合法发展到现在，以多聚甲醛为原料，有机碱为催化剂，1，3-二羟基丙酮产量及选择性得 到了极大改善，但还不能用于工业化生产。
[0004] 因此，探索以甲醛为原料，以酶为催化剂合成1，3-二羟基丙酮具有重要的意义。 首先，地球上的碳一资源丰富，2013年全球甲醛产能约6400万吨，全球甲醇产能10324万 吨，天然气可采储量185. 7万亿立方米，原煤可采储量8915. 31亿吨。同时，酶催化剂具有 活性高，化学选择性高等特点，越来越受到人们的青睐。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有催化甲醛缩合合成 1，3-二羟基丙酮功能的酶，本发明中，将这种具有催化甲醛缩合合成1，3-二羟基丙酮功能 的酶命名为BFD，选自如下（a)~（c)所述的多肽：
[0006] (a)由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的多肽；
[0007] (b)由（a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化 甲醛缩合合成1，3-二羟基丙酮功能由（a)衍生的多肽；
[0008] 例如：在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质 的功能。同时，在C末端或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功能。
[0009] (c)与（a)中的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且具有催化甲醛缩 合合成1，3-二羟基丙酮功能的多肽。
[0010] 另外还包括如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的多肽的基础上的活性片段、或其活 性衍生物、类似物。所述"活性片段"、"活性衍生物"和"活性类似物"是指在基本上保持本 发明BFD多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种多核苷酸，选自如下（a)~（c):
[0012] (d)编码权利要求1中（a)~（c)所述多肽的多核苷酸；优选的，其基因序列为SEQ ID N0. 2或SEQ ID N0. 3中所示序列。
[0013] (e)编码权利要求1中（a)~（c)所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；
[0014] (f)在严格条件下与（d)或（e)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化甲醛缩 合合成1，3-二羟基丙酮功能多肽的多核苷酸；
[0015] 上述条件（g)中的严格条件是指：（1)在较低的离子强度和较高的温度下的杂交 和洗脱，如0. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C;或（2)杂交时加变性剂，如50% (v/v)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/〇. 1% Ficoll，42°C等；或（3)仅在两条序列之间的相同性至少在95%以上，优 选为在97%以上时才发生杂交；并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO. 1所示 的成熟多肽具有相同的生物学活性和功能。
[0016] (h)与（d)或（e)或（f)或（g)限定的多核苷酸序列有70%同一性且编码具有催 化甲醛缩合合成1，3-二羟基丙酮功能的蛋白质的多核苷酸。其中，与上述（d)或（e)或 (f)限定的多核苷酸序列杂交的核酸片段，长度至少含10个核苷酸，优选地，20个核苷酸以 上，更优选地，50个核苷酸以上，最佳为100个核苷酸以上。
[0017] 进一步地，上述多核苷酸为DNA或RNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合 成的DNA。DNA可以单链的或者是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码链中编码 SEQ ID NO. 1所示多肽的编码区序列可以是与SEQ ID N0. 2所示的序列相同或简并的变异 体，简并变异体是指编码具有SEQ ID NO. 1多肽，但与SEQ ID N0. 2所示的序列有差别的核 苷酸序列。
[0018] 本发明的另一目的在于提供一种含有编码BFD多肽多核苷酸的重组载体。
[0019] 所述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物 细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的 基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺 乳动物细胞中表达的MSXND表达载体等。总之，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何 载体都可以用于构建重组表达载体。
[0020] 优选地，所述重组载体为在pET_28a载体的多克隆位点，插入序列表中SEQ ID NO. 2所示DNA片段后，得到的重组质粒（pET-28a-bfd)。可选的，克隆位点为Ndel酶切位 点和Xhol酶切位点。
[0021] 本发明的另一目的在于提供一种转入了含有编码BFD多肽多核苷酸的重组载体 的重组宿主细胞。
[0022] 所述重组宿主细胞包含上述重组载体，且指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核 细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选地为大肠杆菌、酵母。
[0023] 本发明的另一目的在于提供一种具有催化甲醛缩合合成1，3-二羟基丙酮功能的 酶的制备方法，其特征在于，包括以下工序：
[0024] (1)合成具有编码催化甲醛缩合合成1，3-二羟基丙酮功能的酶的基因，并将其构 建在载体上；
[0025] (2)将重组载体在宿主细胞中表达；
[0026] (3)从表达成功的重组宿主细胞中提取纯化具有催化甲醛缩合合成1，3-二羟基 丙酮功能的酶。
[0027] 本发明的另一目的在于提供一种产生1，3-二羟基丙酮的方法，其特征在于，选自 以下工艺的任一种：
[0028] (1)利用权利要求1中（a)~（c)任一项所述的多肽，以甲醛为底物，体外反应产 生1，3-二羟基丙酮；
[0029] (2)利用权利要求6所述的重组细胞，以甲醛为底物，反应产生1，3-二羟基丙酮。
【附图说明】：
[0030] 图1为重组质粒pET-28a-bfd的质粒图谱示意图
[0031] 图2为BFD纯化SDS-PAGE示意图
[0032] 图3为BFD催化甲醛产物GC-MS分析的色谱图
[0033] 图