一种CHO-S细胞半固体培养基及其配制方法与应用与流程
本发明涉及一种适合CHO-S细胞生长的半固体培养基及其配制方法与应用，属于CHO-S细胞株开发领域。
背景技术：
抗体的靶向特异性及高表达量在临床中具有重要意义，因此如何比竞争对手更快一步寻找到能够稳定并大量分泌正确抗体的细胞系就显得尤为重要。对此，传统的细胞筛选采用有限稀释法或细胞分选法，工作量大耗时长，通常筛选1000个细胞需要8周，而最终才能获得一个好的克隆；且在挑克隆的时候容易对细胞造成机械伤害，导致克隆的成活率下降。现在企业常使用半固体培基法进行单克隆筛选。细胞生长在半固体培养基中，形成单克隆细胞团，同时将抗体分泌在细胞团周围，半固体培养基中含有荧光标记的二抗，能与抗体Fc片段特异性结合，当用一定波长的光进行激发时就能发出荧光。使用图像分析软件能够对单克隆细胞团的大小、荧光强度进行测定，从而筛选出生长旺盛、表达量高的单克隆细胞团。Molecular Device公司开发的Clone Pix system筛选方法(参考《CHO细胞株开发技术策略探讨》)有效地避免了人工筛选细胞的弊端，可在短时间内挑选大量克隆，基于荧光检测技术但无需表达载体自身产生荧光，从而有效地避免了假阳性；细胞处于半固体培养基中，挑选过程柔和，增加了细胞的存活率，因此效率大大提高。
在CHO细胞克隆筛选中，以Clone Pix system筛选方法为例，适合CHO细胞生长的半固体培养基是其中最关键环节之一。Molicular Devices公司开发了适合各种细胞生长的半固体培养基，其中适合CHO-S细胞的半固体培养基CloneMedia-CHO-G(Cat：K8740)价格非常昂贵，90mL售价4251元，货期长，物流成本高，且少有此款产品的替代品，因此有关CHO-S细胞开发的研发成本非常高。除了固定成分外，半固体培养基的配制方法也对细胞生长起重要作用。而CloneMedia-CHO-G半固体培养基的配方和配制方法均为Molicular Devices的商业秘密，不为公众所知。
因此，有必要开发新的适合CHO-S细胞生长的半固体培养基及其制备方法，以 降低科研成本，增大实验材料的选择自由度。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种CHO-S细胞半固体培养基，该半固体培养基适合于CHO-S细胞生长，可用于细胞克隆筛选阶段，能有效替代Molicular Devices公司开发的适合CHO-S细胞的CloneMedia-CHO-G半固体培养基。
本发明的另一个目的是提供一种配制适合CHO-S细胞半固体培养基的方法。
为解决上述问题，本发明的技术方案为：
一方面，本发明提供一种CHO-S细胞半固体培养基，按重量百分比计，所述半固体培养基包含如下组分：2.46％～2.48％CD FortiCHO培养基，2％～3％甲基纤维素。
根据本发明的具体实施方案，本发明的CHO-S细胞半固体培养基由2×CDFortiCHO和2×甲基纤维素溶液按照体积比1:1充分混匀后离心除去肉眼不可见颗粒，收集上层离心液得到。
优选地，上述CD FortiCHO培养基为固体培养基CD FortiCHO AGT Medium Prototype或CD FortiCHO II，这些固体培养基可由gibco公司商购获得。
优选地，按质量体积比计算，所述甲基纤维素在20℃下、2％时的黏度为25cps～1500cps。
在本发明的一种实施方式中，所述甲基纤维素的平均分子量为17000～63000。
优选地，所述甲基纤维素的含量为2.7％～3.0％。
另一方面，本发明还提供了一种配制所述CHO-S细胞半固体培养基的方法，该方法包括：
a、将体积比为1:1的2×CD FortiCHO培养基和2×甲基纤维素溶液充分混匀；
b、离心除去肉眼不可见颗粒物质，收集上层离心液，即得CHO-S细胞半固体培养基；其中，优选地，所述离心条件为4000rpm～10000rpm，离心30min以上。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述2×CD FortiCHO培养基是按照以下方法制得的：称量CD FortiCHO培养基，加入超纯水，充分搅拌溶解，0.20μM滤膜过滤除菌得到2×CD FortiCHO培养基。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述2×甲基纤维素溶液是按照以下方法制得的：称量甲基纤维素，加入超纯水，充分搅拌溶解，高压灭菌得到2×甲基纤 维素溶液。高压灭菌条件可为常规培养基灭菌条件，例如可为121℃左右高压灭菌30min。
半固体培养基的配制方法通常通过肉眼观察培养基澄清透亮且无固体颗粒物即判断为搅拌均匀、各组分充分溶解。一般通过延长搅拌时间或加大搅拌力度或通过煮沸等方式保证半固体培养基各组分充分溶解。但通过上述本领域常规方法配制的半固体培养基在实际应用中效果并非最佳，应用效果低于商品化半固体培养基。而在教科书的教导下，本领域普通技术人员通常认为半固体培养基充分搅拌溶解，肉眼观察澄清即可，更不会进一步探究其微观形态对应用效果的影响，也未就此检索到相关的科技文献或专利文献报道。
本案发明人偶然将上述半固体培养基置于光学显微镜下观察发现，肉眼观察无固体颗粒的半固体培养基中仍存在大量细小难溶的固体颗粒物。进一步研究发现，离心可除去这些固体颗粒物，并将离心后的CHO-S细胞半固体培养基用于CHO-S细胞培养。试验结果表明：离心处理的半固体培养基与未做离心处理的半固体培养基相比，CHO-S细胞生长大，蛋白表达量高，生长状态相对较好，有益于后续细胞筛选工作。离心处理后的CHO-S细胞半固体培养基用于培养CHO-S细胞，获得了预料不到的技术效果，超出了本领域技术人员的预期。
所述离心条件的判断标准为在光学显微镜下观察所述半固体培养基无细小固体颗粒物(即，在光学显微镜下观察无可见的固体颗粒物)。优选地，本发明推荐离心条件为4000rpm～10000rpm，离心30min以上。本领域技术人员可以根据具体实验条件、离心机转子大小选择更具体的转速和离心时间。优选地，离心操作最好是在低温下进行，比如4℃低温离心。特别是含有CD FortiCHO培养基的离心操作尽量4℃低温操作。
另一方面，本发明还提供了所述CHO-S细胞半固体培养基在培养CHO-S细胞中的应用。具体应用时，培养CHO-S细胞时的培养条件为：5％CO2，36.5℃。优选地，是静止培养箱培养或120rpm摇瓶培养。试验结果表明：本发明的CHO-S细胞半固体培养基用于培养CHO-S细胞，CHO-S细胞生长大，蛋白表达量高，生长状态相对较好，有益于后续细胞筛选工作。
本发明的有益效果：
本发明提供的CHO-S细胞半固体培养基适合CHO-S细胞生长，能够用于细胞克 隆筛选阶段，为科研工作者或企业提供更多选择；可用于替代Molicular Devices公司的CHO-S细胞半固体培养基CloneMedia-CHO-G，进而降低进口产品过长的供货期对科研工作的影响，降低企业对该产品的依赖性；90mL CloneMedia-CHO-G的售价为4251元人民币，而配制相同体积的本发明所述半固体培养基的成本约为130元人民币，因此，采用本发明所述的半固体培养基替代Molicular Devices公司的CHO-S细胞半固体培养基CloneMedia-CHO-G可大幅降低研发生产成本；通过本发明提供的配制CHO-S细胞半固体培养基的方法配制的CHO-S细胞半固体培养基用于细胞培养，细胞生长大，蛋白表达量高，生长状态好，取得了预料不到的效果，超出了本领域普通技术人员的预期；本发明提供的配制方法操作简单，可行性强，结合大容量离心机，可批量配制半固体培养基以满足研发生产需求。
附图说明
图1为自配CHO-S细胞半固体培养基未离心50倍放大图，培养基配方见实施例1。
图2为自配CHO-S细胞半固体培养基离心50倍放大图，培养基配方见实施例1。
图3为自配CHO-S细胞半固体培养基未离心50倍放大图，培养基配方见实施例2。
图4为自配CHO-S细胞半固体培养基离心50倍放大图，培养基配方见实施例2。
图5为自配CHO-S细胞半固体培养基(未离心)克隆第六天生长状态白光图，50倍放大，培养基配方见实施例1。
图6为自配CHO-S细胞半固体培养基(未离心)克隆第六天生长状态荧光图，50倍放大，培养基配方见实施例1。
图7为自配CHO-S细胞半固体培养基(离心)克隆第六天生长状态白光图，50倍放大，培养基配方见实施例1。
图8为自配CHO-S细胞半固体培养基(离心)克隆第六天生长状态荧光图，50倍放大，培养基配方见实施例1。
图9为自配CHO-S细胞半固体培养基(离心)克隆第六天生长状态白光图，50倍放大，培养基配方见实施例2。
图10为自配CHO-S细胞半固体培养基(离心)克隆第六天生长状态荧光图，50 倍放大，培养基配方见实施例2。
图11为自配CHO-S细胞半固体培养基(离心)克隆第六天生长状态白光图，50倍放大，培养基配方见实施例4。
图12为自配CHO-S细胞半固体培养基(离心)克隆第六天生长状态荧光图，50倍放大，培养基配方见实施例4。
图13为自配CHO-S细胞半固体培养基(离心)克隆第六天生长状态白光图，50倍放大，培养基配方见实施例6。
图14为自配CHO-S细胞半固体培养基(离心)克隆第六天生长状态荧光图，50倍放大，培养基配方见实施例6。
图15为商业CHO-S细胞半固体培养基CloneMedia-CHO-G克隆第六天生长状态白光图，50倍放大。
图16为商业CHO-S细胞半固体培养基CloneMedia-CHO-G克隆第六天生长状态荧光图，50倍放大。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的技术方案及其特点和应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。
实施例1、CHO-S细胞半固体培养基配方
材料：
CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供应商Gibco，货号A14286EF；
甲基纤维素，供应商Sigma，货号M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为400cPs。
按照重量百分比计：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，2％甲基纤维素。
实施例2、CHO-S细胞半固体培养基配方
CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供应商Gibco，货号A14286EF；
甲基纤维素，供应商Sigma，货号M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为400cPs。
按照重量百分比计：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，3％甲基纤维素。
实施例3、CHO-S细胞半固体培养基配方
CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供应商Gibco，货号A14286EF；
甲基纤维素，供应商Sigma，货号M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为400cPs。
按照重量百分比计：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，2.7％甲基纤维素。
实施例4、CHO-S细胞半固体培养基配方
CD FortiCHO II粉末，供应商Gibco，货号A24363SA；
甲基纤维素，供应商Sigma，货号M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为400cPs。
按照重量百分比计：2.48％CD FortiCHO II，2％甲基纤维素。
实施例5、CHO-S细胞半固体培养基配方
CD FortiCHO II粉末，供应商Gibco，货号A24363SA；
甲基纤维素，供应商Sigma，货号M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为400cPs。
按照重量百分比计：2.48％CD FortiCHO II，2.7％甲基纤维素。
实施例6、CHO-S细胞半固体培养基配方
CD FortiCHO II粉末，供应商Gibco，货号A24363SA；
甲基纤维素，供应商Sigma，货号M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为400cPs。
按照重量百分比计：2.48％CD FortiCHO II，3％甲基纤维素。
实施例7、CHO-S细胞半固体培养基配方
CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供应商Gibco，货号A14286EF；
甲基纤维素，供应商Sigma，货号M6385-500G，平均分子量17000，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为25cPs。
按照重量百分比计：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，3％甲基纤维素。
实施例8、CHO-S细胞半固体培养基配方
CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供应商Gibco，货号A14286EF；
甲基纤维素，供应商Sigma，货号M0387-500G，平均分子量63000，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为1500cPs。
按照重量百分比计：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，2％甲基纤维素。
实施例9、CHO-S细胞半固体培养基配方
CD FortiCHO II粉末，供应商Gibco，货号A24363SA；
甲基纤维素，供应商Sigma，货号M6385-500G，平均分子量17000，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为25cPs。
按照重量百分比计：2.48％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，3％甲基纤维素。
实施例10、CHO-S细胞半固体培养基配方
CD FortiCHO II粉末，供应商Gibco，货号A24363SA；
甲基纤维素，供应商Sigma，货号M0387-500G，平均分子量63000，在20℃下，2％的该甲基纤维素黏度为1500cPs。
按照重量百分比计：2.48％CD FortiCHO II，2％甲基纤维素。
实施例11、CHO-S细胞半固体培养基的配制方法
CHO-S细胞半固体培养基按照如下步骤配制：
(1)2×CD FortiCHO培养基准备：准确称量CD FortiCHO AGT Medium Prototype或CD FortiCHO II固体培养基，加入超纯水，400rpm磁力搅拌器搅拌30min使充分溶解，然后用0.20μM滤膜(sartolab-P20plus，cat：18056)过滤除菌得到2×CDFortiCHO培养基，4℃冰箱保存备用。
(2)2×甲基纤维素溶液准备：准确称量甲基纤维素加入纯化水，400rpm磁力搅拌器皿充分搅拌60min使溶解，121.3℃高压灭菌20分钟，待降为室温后，放入4℃冰箱保存30分钟以上备用。
(3)在生物安全柜中将已经配制好的2×CD FortiCHO培养基和2×甲基纤维素溶液按照1:1的体积比混合，4℃600rpm磁力搅拌器搅拌过夜。
(4)将步骤(3)所得半固体培养基分装在50mL无菌离心管内，4000rpm离心30min至上清液在显微镜下50倍放大观察无细小难溶固体颗粒物，丢弃离心管最底层固体培养基(约5mL)，收集上层半固体培养基，-20℃冰箱保存备用。
实施例12、CHO-S细胞半固体培养基(离心与未离心)与商业CHO-S细胞半固体培养基CloneMedia-CHO-G培养CHO-S细胞生长状态比对
试验材料：
(1)实施例1 CHO-S细胞半固体培养基，按照实施例11所述步骤1-4配制，得到离心自配CHO-S细胞半固体培养基。
(2)实施例1 CHO-S细胞半固体培养基，按照实施例11所述步骤1-3配制，得到未离心自配CHO-S细胞半固体培养基。
(3)实施例2 CHO-S细胞半固体培养基，按照实施例11所述步骤1-4配制，得到离心自配CHO-S细胞半固体培养基。
(4)实施例4 CHO-S细胞半固体培养基，按照实施例11所述步骤1-4配制，得到离心自配CHO-S细胞半固体培养基。
(5)实施例6 CHO-S细胞半固体培养基，按照实施例11所述步骤1-4配制，得到离心自配CHO-S细胞半固体培养基。
(6)商业CHO-S细胞半固体培养基CloneMedia-CHO-G，Molicular Devices，Cat：K8740。
(7)CHO-S宿主细胞，上海津曼特生物科技有限公司，表达IgG。
试验方法：
将本发明提供的CHO-S细胞半固体培养基(离心与未离心)与Molicular Devices商业CHO-S细胞半固体培养基用CHO-S宿主细胞进行铺板，比较二者的细胞生长和IgG蛋白表达量。
配制的半固体培养基和商业培养基从-20℃冰箱分别取出，放在4℃冰箱过夜，溶解完全。如果铺一块6-well plate，细胞房超净工作台里，在50ml无菌离心管中，加入15ml半固体培养基，再加入0.6ml L-Glutamine(Gibco，200mM，cat：25030-081)，接着加入150μl的CloneDetect(Molicular Devices，cat：K8200)，然后将其充分混合，再加入3000～12000个细胞(也就是500～2000个细胞每个孔)，再次混合均匀，取2ml混合物到每个孔中(避免汽包产生，并且平铺)。最后放入恒温培养箱(36.5℃，5％CO2)培养6天。
试验结果：见图1-图16。
图1与图2、图3与图4为自配CHO-S细胞半固体培养基离心与未离心液体50 倍放大图。结果显示，未离心CHO-S细胞半固体培养中仍存有大量细小难溶固体颗粒物，颗粒物实际粒径约10-50μm。
从未离心与离心的CHO-S细胞自配半固体培养基培养CHO-S细胞生长状态来看(见图5～图14)，未离心的CHO-S细胞自配半固体培养基背景杂质多(图5、图6)，细胞生长相对较小，IgG蛋白表达量低，生长状态相对较差；而离心的CHO-S细胞自配半固体培养基背景较为清澈，细胞生长较大，IgG蛋白表达量较高(细胞克隆表达的抗体荧光图直径约1-2mM)，生长状态相对较好(图7-图14)。
离心的自配CHO-S细胞半固体培养基(图7-图14))与商业CHO-S细胞半固体培养基培养CHO-S细胞生长状态(图15、图16)相比较，离心自配半固体培养基CHO-S细胞克隆生长较为紧凑，荧光强度和大小部分克隆表现较强。
上述试验结果表明本发明提供的离心自配CHO-S细胞半固体培养基应用效果基本达到甚至优于Molicular Devices商业半固体培养基；本发明提供的半固体培养基配制方法有利于提高其应用性能。
实施例13、离心自配CHO-S细胞半固体培养基与商业CHO-S细胞半固体培养基CloneMedia-CHO-G Fed-batch培养CHO-S细胞
试验方法：将实施例12配制的CHO-S细胞半固体培养基离心液体(培养基配方见实施例1)和商业培养基(同实施例12)从-20℃冰箱分别取出，4℃冰箱过夜溶解。在细胞房超净工作台铺一块6-well plate：50ml无菌离心管中加入15ml半固体培养基，再加入0.6ml L-Glutamine(Gibco，200mM，cat：25030-081)，接着加入150μl的CloneDetect(Molicular Devices，cat：K8200)，将其充分混合后加入3000～12000个细胞(即500～2000个细胞/孔)，再次混合均匀，取2ml混合物到每个孔中(避免汽包产生，并且平铺)。最后放入恒温培养箱(36.5℃，5％CO2)培养6天。挑选克隆到96-well中培养5天，以Elisa titer高低和生长状态从96-well中挑选出一定克隆到24-well中培养5天，同样以Elisa titer高低和生长状态从24-well中挑选出一定克隆到6-well中培养5天，最后仍然以Elisa titer高低和生长状态从6-well中挑选出较少克隆到摇瓶进行培养，5天左右，将克隆一部分安全冻存，剩下进行Fed-batch培养。
对照组为Fed-batch培养母克隆sub 1。试验用所有亚克隆均从母克隆sub 1铺板挑选克隆筛选得到。
Fed-batch培养条件：250ml摇瓶接种50ml，摇床转速130rpm，36.5℃培养，两组实验补料时间和次数均相同，第6天进行降温。
Fed-batch培养结果见表1-表2。
表1 离心自配CHO-S细胞半固体培养基Fed-batch CHO-S细胞生长曲线
表2 Molicular Devices商业半固体培养基CloneMedia-CHO-G Fed-batch CHO-S细胞生长曲线
离心自配CHO-S细胞半固体培养基筛选出十个克隆，生长最高密度达27×106cells/ml，活率大部分克隆在50％以上(14天)，最高IgG抗体表达滴度达3.19g/L。商业半固体培养基CloneMedia-CHO-G筛选出十个克隆，生长最高密度达28×106cells/ml，活率大部分克隆在50％以上(14天)，最高IgG抗体表达滴度达3.25g/L。
以上试验数据表明：本发明提供的离心自配CHO-S细胞半固体培养基应用效果基本达到Molicular Devices商业半固体培养基CloneMedia-CHO-G，可以替代其用于日常生产研发；本发明提供的半固体培养基配制方法有利于提高其应用性能。
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